图3-1 DNA分子的平面结构
磷酸(P)和脱氧核糖(D)在DNA链的外侧，碱基(A:T、C:G)
在链的内侧互补配对，两条链通过碱基的氢键相连接

（二）基因与表达 基因是遗传物质的最小功能单位。从分子水平而言，基因是DNA分子中负载遗传信息的特定核苷酸序列。基因包括结构基因和调控基因等多种形式。DNA链中的遗传信息如何控制生物的某种表型性状呢?主要是通过DNA的复制、转录和翻译而使基因得以表达来控制的。不同的蘑菇之所以有不同的形态特征和生理代谢，就在于它们的遗传基因各不相同。
基因决定蛋白质的结构和功能。基因的化学成分是4种脱氧核苷酸，蛋白质的化学成分是20种氨基酸。脱氧核苷酸单链中每3个碱基为一组遗传密码，可形成433=64组密码，对应于20种氨基酸绰绰有余。
DNA主要存在于细胞核内，蛋白质却是在细胞质内的核糖体上合成，所以，需要RNA(核糖核酸)作为信使把核内DNA的遗传信息转录到核外，在核糖体rRNA和转运tRNA的帮助下，由不同的三联体密码转译为各种氨基酸。氨基酸序列的不同决定了蛋白质的复杂性，进而也就有了生物性状的多样化。DNA的复制、转录和转译等生物化学过程如图3-2所示。

图3-2 DNA的复制、转录和转译
遗传信息的传递(从基因到蛋白质)经历两个阶段:第一阶取段
为转录，按照DNA转录链的遗传密码顺序合成mRNA；第二阶
段为转译，tRNA把氨基酸运载到核糖体上，核糖体从左到右
沿着mRNA移动，氨基酸顺序由mRNA的密码顺序决定，氨基
酸由肽键连接成多肽链
    第二节 蘑菇的性与生活史
什么是性? 性即重组。高等生物的雌雄个体交配后，双亲的遗传基因发生重组，因而造就了子代的多样性。双孢蘑菇的“性”行为如何呢？本节予以论述。
一、蘑菇的生活史
双孢蘑菇的生活史指从担孢子萌发，经生长发育又生成担孢子的循环过程(图3-3)。

图3-3 蘑菇生活史
（1）成熟子实体；（2）担孢子；（3）孢子萌发；（4）～（5）菌丝体；（6）原基；（7）菌蕾；（8）开伞菌体；（9）担子和担孢子

上图表示，成熟双孢蘑菇（1）开始弹射担孢子，弹射时先是在担孢子的小梗基部分泌出水滴，由于渗透压力的作用，水滴在几秒钟内就膨大爆裂，使担孢子迅速与小梗脱离而弹射出担孢子；双核的担孢子（2）萌发后形成多核的异核菌丝体（3）～（5）；之后经过各发育阶段如原基（6）、菌蕾（7），一直到到开伞菇（8），菇体中所有的细胞都维持多核异核体的状态；只有在担子（9）形成中，多核异核体才变成双核异核体，经过核融合与减数分裂，重新产生两个双核的担孢子。
一个蘑菇在成熟后能弹射出千万个双核的担孢子，绝大多数担孢子内含交配型不同(A1和A2)的两个核，这种双核担孢子萌发出可孕的多核的异核菌丝体，不产生锁状联合，自体可育而出菇，这种遗传模式称为次级同宗结合。
在担子菌中，同宗结合的种类约占10%，除双孢蘑菇外，典型的同宗结合是草菇，其与双孢蘑菇不同之处是其担孢子为单核，萌发出多核的同核菌丝可结实，被称为初级同宗结合。
担子菌中，异宗结合的种类约占90%，如平菇、香菇、金针菇等，这些菇种的单核担孢子自身不育，与双孢蘑菇及草菇有很明显的区别。
在正常情况下，蘑菇的担子上仅产生两个担孢子（图版16，左），1个担孢子可获得减数分裂4个核中的2个核，因此得名“双孢蘑菇”。但是也有例外，双孢蘑菇的担子偶尔也能产生3个（图版16，右）或4个担孢子。如果对双孢蘑菇的担孢子进行足够数量的单孢子分离，就有可能获得“四孢蘑菇”。1992年，在美国加州分离出了双孢蘑菇的“四孢变种”。
Phillippe（1995）揭示了双孢蘑菇与四孢蘑菇有性生殖的差异（图3-4）。

图3-4 双孢蘑菇与四孢蘑菇有性生殖的差异
双孢蘑菇与四孢蘑菇弹射出的担孢子是不同的，统计结果为：双孢蘑菇2孢担子占81%，3孢担子占18%，4孢担子占1%；四孢蘑菇4孢担子占85%，3孢担子占14%，2孢担子占1%。2孢担子弹出的双核担孢子萌发出初级菌丝即是异核体（n＋n），自身可出菇，这是同宗结合的特征；四孢担子弹出的是单核担孢子，萌发出的初级菌丝是同核体（n），同核体之间须经融合质配形成异核的（n＋n）次级菌丝才能出菇，这是异宗结合的特征。杂交研究表明，四孢担子性状相对于双孢担子性状是显性的，而三孢担子介于二者之间。须指出，蘑菇科中除双孢蘑菇外，其它的种如大肥菇、野蘑菇、褐鳞蘑菇等都是四孢蘑菇（图版17）。
    二、蘑菇的减数分裂
虽然双孢蘑菇有80%以上的双核担孢子自体可育，但是偶尔发现少数担孢子虽然具有双核，但是自体不育。这是为什么？经过遗传学家们长期研究得知，双孢蘑菇的交配系统受A1和A2 (或“十”和“－”)一对交配因子所控制，即某个担孢子只有同时含有不同交配因子A1、A2才是自体可孕的；如果该担孢子的2个核同时含有同样的A1或A2交配因子，则自体是不可孕的。
Evans（1959）研究了双孢蘑菇担子中的减数分裂行为，他根据减数分裂过程中纺锤丝的动态变化，提出了“非随机分离”的理论假说。Evans认为，不孕担孢子的形成，起因于担孢子形成时纺锤丝的排列差异，因此对减数分裂所形成的4个细胞核牵拉方向不同，最后会形成A、B、C、D这4种不同类型的担孢子，各种担孢子形成的机率如图3-5所示。

图3-5 纺锤丝拉向对孢子内核排列的影响
上图可以理解为：孢子中有20%的A类担孢子2个核相同（同核体），即交配因子相同而不能出菇；孢子中占80%的B、C、D三类担孢子因2个核不同（异核体），即交配因子不同则可以出菇。但是须明确，如果交配因子在减数分裂的第一次分裂时分离，产生异核体的机率是80%；如果交配因子在减数分裂的第二次分裂时分离，产生异核体的机率则为60%。这是由于第二次分裂分离时，染色体上交配因子所在的位点在着丝粒间发生了交换。
上述“非随机分离”的遗传机制，被解释为是双孢蘑菇为防止同核体隐性纯合可能导致的致残、致死效应，在进化过程中选择出非随机迁移机制，因而保持了双孢蘑菇担孢子的异核特性。但是有些学者对这种解释提出了不同的见解认为，双孢蘑菇减数分裂中的核移动也是正常的，即4分体核随机配对进入2个担孢子。但是同核体担孢子不易萌发，生存能力低下，由此可能导致同核体在实验观察中被遗漏，造成同核孢子比率低于其真实比率的现象。事实上也是如此，分析试验基本上都是以孢子萌发成的菌丝体为材料进行的。如果只有异核孢子才能正常萌发出菌丝，而同核孢子不易萌发，试验结果会显示同核孢子比率偏低。Elliott（1980）以营养缺陷型为标记进行研究，其结果支持双孢蘑菇减数分裂核的分配是随机的观点，并建立了模式图(图3-6)，说明减数分裂后四个核是随机分配进入两个孢子，一个孢子接受异核的概率是接受同核概率的2倍，即异核体:同核体=2:1。

图3-6 蘑菇减数分裂产物随机配对模型
由于以双孢蘑菇为试验材料不容易得到子实体进行检测，Elliott等(1983)以双孢的墨汁鬼伞营养缺陷型菌株为试验材料，检测了营养缺陷型标记在次级同宗配合中的预期分离比例，所获得的数据和原养型对营缺型分离株的5:1的预期比例完全吻合。王泽生等（1991）以酯酶同工酶（Est）为遗传标记，研究标记位点EstA、B和C在杂交子二代中的分离与重组行为，也发现等位基因的分离比例为1:4:1。这些研究结果都表明，双孢蘑菇与其它担子菌的减数分裂机制差别不是本质上的，4个核是随机配对迁移入两个担孢子的。
随机迁移假设的重要性是它预期了基因的分离比例，并可以绘制出基因在染色体上的位置。多伦多大学生物系的Xu等（1993）采用随机扩增多态性DNA技术（RAPD），对双孢蘑菇的交配因子进行了染色体与DNA水平上的研究，成功地将其交配因子定位在蘑菇最大的基因连锁群—I号染色体上，所用的遗传标记距交配因子位点有35个遗传图距(约600Kb)。
    第三节 蘑菇的杂交育种
早期的蘑菇育种均采用多孢分离方法，但这种方法改良菌株的进程缓慢。Sinden(l981)叙述了他采用多孢筛选法获得A6菌株的经过，他前后经过近30年的努力，但A6也不是理想的菌株。我国采用多孢筛选法约有30年，但始终没有留下明显进步的菌株。这是因为多孢分离获得的菌株，在遗传上均一性大于变异性，从理论上就不合理，所以难于获得具有明显变异性状的菌株。
单孢分离比多孢分离具有更大的机率筛选出明显变异的新菌株，尽管单孢分离是一种费时的工作。福建省轻工业研究所（1983）从一些菌株中分离了近千个单孢培养物，获得了10株具有较好种性的新菌株，其中“闽1号”菌株曾在省内外广泛使用。
虽然孢子分离选种曾经为蘑菇商业性栽培提供了许多重要的菌株，但是这些菌株仍然存在难以克服的缺点，即高产的菌株常常不优质，而优质的菌株常常不高产。为了选育兼具高产与优质特性的菌株，育种者很自然地着眼于杂交方法的研究。
杂交育种在动植物育种中的应用已有长久的历史而且取得巨大的成就，为什么在蘑菇育种中迟迟没有应用呢? 因为在技术上有两个障碍：一是双孢蘑菇遗传机制特殊，大多数孢子是自身可育的;二是鉴别杂种的技术效率低。随着对蘑菇遗传系统的深入研究，蘑菇的杂交育种工作有了新进展。
如何鉴别杂种呢? 关键是杂交亲本要具有某种遗传标记。1972年，Raper等提出利用营养缺陷型标记；1978年，Elliott利用菌株的抗药性为标识；1982年，Royse和may提出应用同工酶作为杂交标记。为说明问题，下面介绍蘑菇杂交育种的典型范例。
    一、遗传相关性的应用
十九世纪，法国纯培养的双孢蘑菇菌种问世并于1915年传入美国。纯培养技术可使某一生产性状理想的菌种得以很好的保存，因而人们不再主动从自然界中发掘新种质资源，即使偶然发现也不保种。长此以往，随着野生环境变化，本来种类繁多的双孢蘑菇自然种质资源趋于枯竭。
由于可供选择的遗传标记很少，利用营养缺陷型和异核菌丝所表现的一般显性遗传标记颇有困难，这防碍了双孢蘑菇的杂交育种。
生化基因位点的变异可作为其显性标记，并可用来检测同核体，以进一步确定在相应的纯合育种材料之间的核交换，也可用来将蘑菇各菌株归划为不同基因型类型。采用电泳方法定量地估算许多不同菌株间的遗传变异，深入了解菌株间的分类关系。遗传相关性最小的菌株间杂交可以丰富遗传多样性，并可控制某一数量性状的杂合位点以及纯合位点的最佳结合。
D.J.Royse（1982）对双孢蘑菇162个试验菌株和34个生产用菌种中已知的等位基因酶蛋白变化进行了比较，对这些菌株间的关系有了进一步的深入了解，并提出改进蘑菇数量性状的选育方案。其研究方法及结果如下：
（一）材料和方法
1．菌株 试验所用的蘑菇菌株由宾夕法尼亚州大学蘑菇菌种中心(PSUmCC)及菌种制造商提供，这些菌种来自世界各地，用以下基本方法分离:①组织分离；②单孢分离; ③多孢分离。收集的原始菌种用液氮保存，或在马铃薯葡萄糖酵母膏琼脂培养基(PDYA)上置于2～3℃保藏，60天左右转管一次。
2．电泳 从菌丝培养皿中挑出琼脂块，接种在装有100毫升马铃薯、葡萄糖、酵母膏、肉汁培养基(PDYB)的250ml烧瓶中，待菌丝在此液体培养基中生长2～4周以后，用Whatman l号滤纸过滤出菌丝体，并置于装有少量0.O5m Tris HCl缓冲液(PH=7.1)的试管内(l2×75mm),用玻棒搅动供同工酶分析。
平板淀粉凝胶电泳按May等(1979)的方法，染色采用Allendorf等(1977)的方法。
3．同工酶和基因名称 检测四种多形态酶(代表5个位点)，即醇脱氢酶(ADH);谷氨酸丙酮酸转移酶(ADH);磷酸甘露糖异构酶(MPT)和舦酶(PEP-LLL)。基因名称按May等(1979)的方法命名，缩写的大写字母代表酶的名称，第一个大写字母表示专门编码该酶的遗传位点，若编码该酶的位点不止一个，则另加字母表示(如PEP酶)。某一位点的等位基因以它们的同质体蛋白产物为原点，按其向正极或负极的相对迁移率来标记，这种表示方法是相对于定为100的一个等位基因(通常是最常见的等位基因)的同质体蛋白来说的。
4．遗传相关性 按同工酶的变化，把供试双孢蘑菇菌株划分成27类基因型。遗传相似系数的计算按Rogers(1972)方法，将27类基因型两两配对，计算出每一对基因型之间的遗传相似系数。依照各类基因型5个位点上的等位基因值，进行阶梯式比较，并画出用遗传相似系数来表示相关关系的分枝图。合并最相似的基因型类，并重新计算出合并后的新类的等位基因值，然后再计算出新的相似值。把最相似的两类基因型合并。在阶梯式比较中，新的等位基因值要用每一类基因型样本量加权。例如，由第5、7、8类基因型组成的新类，其样本量为3。
（二）结果与分析 供试的34个菌株仅属五种基因型类。根据5个位点上等位基因酶蛋白的变化，27类基因型的遗传相似系数以阶梯式列于图3-7。从0.23(低值)到0.90(高值)，相似系数为1.0时，两类基因型被看成是完全相同。

图3-7 蘑菇27类基因型的遗传相似系数
（χ—平均相似数，是各相似数相加后的平均值）

图中所列27类基因型只不过代表了34个菌株内所有总变异的一部分，总的基因型有可能在2万种以上。
图中数据是每一类基因型与所有其它基因型之间的遗传相似系数的平均值，例如第15类基因型的平均遗传相似系数值是把第15类与其它26类基因型之间的相似系数相加再除以26所得。所有27类中，第17、第4类基因型平均遗传相似系数值最低(分别为0.42和0.44)。从图中可查知每一类基因型与其它各类基因型之间的最高遗传相似系数值，如第4和第14类的“最高遗传相似系数值”最低，表明它们与其它基因型之间有较大的差别。第l7类与第26类、第10类之间的遗传相似系数值最低(仅0.23)，这是因为第10类和第26类是平滑型白蘑菇，而第17类是棕色类型菌株，即差异较大，遗传相似系数值最低。
图3-8是表示各类基因型之间关系的分枝图。根据5个生化位点上的等位基因值，画出27类基因型遗传相似分枝图。每类基因型中包括的菌株数从1到70不等。图右标有各类基因型的子实体菌伞的主要颜色。属同类基因型的菌株，其菌伞色大体相同。第2、18、22类例外，属于这三类基因型的菌株形成的菌伞的颜色分别为白色和奶油色，灰白色和奶油色，白色和奶油色。用作商品栽培的菌株，其基因型类属划圈标出。

图3-8 遗传相似分枝图
某一物种内遗传变异的性质和范围取决于繁殖方式。在生产上，双孢蘑菇主要是无性营养繁殖，缺乏分裂重组或很少有突变，因而某菌株一般都会一直保持其纯系的特性；如果进行有性繁殖即孢子分离，则会发生基因重组和突变，经过多年以后，菌株的纯度就会降低。但是，双孢蘑菇占优势的双孢担子(异核孢子)导致高度自交，这种繁殖方式很难实现基因杂合，因而双孢蘑菇的遗传性状较其它菇种稳定。这为单孢分离试验所证实，也就是说90%的单孢分离材料由于是异核的，因而无法用于杂交。
杂合位点的多少与生物体的生长优势呈正相关。例如，由两个自交亲本(指生长调节位点高度纯合的亲本菌株)杂交产生的子代一般总是比双亲有更强的生长优势。双孢蘑菇的同核体相当于所说的自交系。
同工酶的变化可以反映出控制生产性状(抗病性、总生产率等)的基因位点的变化。培育染色体组有最大杂合性的新菌株，可靠的途径是在有最大基同型差异的同核体之间进行杂交。那末，确定遗传性差异的综合办法就是利用图3-8，并参考表3-2中的数据。如果育种目标是大型白蘑菇，可逐一比较灰白色与大的金黄白蘑菇之间的遗传相似系数。从表3-2查知，这两类之间遗传相似系数最低值为0.40(第20与第9类)。用这两类菌株的同核体进行杂交产生的后代具有最大的遗传异质性。在交配试验中选择某几种特定的生产性状是一个复杂多变的过程，但菇盖色泽始终是白色的。
根据以上论述和有关遗传育种知识，总结出以下较为通用的育种程序：
1．从世界各地收集遗传特性各不相同的菌株，包括野生种。
2．通过显微单孢分离、多孢稀释分离或是用原生质体分离等方法，从四分体中选择可能是同核体的培养物。
3．用同工酶分析法对同核体进行鉴定。
4．单核体相互交配后，在融合线处分离出可能是异核体（F1）的培养物，它的同工酶位点上应有与亲本不同的遗传差异。
5．栽培出菇，并进行同工酶分析，检测是否为杂种。
6．选择单孢后代，以利用减数分裂重组或分离。
7．选用新基因型的单孢子F2代，回复至上述第4步。
8．进行生产性试验，鉴定抗病性、生产率等性状。
上述育种程序的优点是丰富了双孢蘑菇的遗传基础，并确保每一步骤都有相应的可鉴别的同工酶标记。在以前这是办不到的。
    二、荷兰的蘑菇育种成就
荷兰是蘑菇生产的先进国家，大部分菇场主要集中在东南部，闻名于世的霍斯特（Horst）试验站正好位于蘑菇产区的中心，阿姆斯特丹东南100英里处。试验站由仪器设备完备的实验室、办公室，以及堆肥工场和16间菇房(其中8间为120平方米的大菇房，8间为25平方米的小菇房)组成。自1977年起，试验站一直是农业部的一个机构，但其资金的50%是由栽培者资助的。
Horst试验站的堆肥场里有4条发酵隧道，每条隧道的容量为4吨堆肥。后发酵和发菌期间可以改变某些控制条件。大菇房里，蘑菇栽培在由悬臂结构支撑的床架上。有5层菇床，每层菇床划分成16个长2米、宽0.65米的试验小区。由于全部试验是在完全相同的栽培条件下进行比较的，又接近实际生产规模，所以能得出较为科学的重要结论并可直接用于实践。
Horst试验站在蘑菇育种研究方面卓有成就。例如该站的Fritsche利用蘑菇不育单孢菌株配对杂交，以恢复可育性为标记选育杂种，于1981年首先获得纯白色蘑菇和米色蘑菇品系间杂交的品种Ul和U3，此杂交种曾在各国广泛栽培。Fritsche（1986）在退休前，撰文总结了其在Horst试验站工作30年的蘑菇育种成就，对有志于这方面研究的后来者具有重要的参考价值，特作以下简述。
Fritsche从1957年1月开始在汉堡跟随森布许教授进行蘑菇菌种的选育工作，当时仅仅是选育较优良的菌株。进行多孢子培养较省事，但是不同孢子长出的菌丝融合在一起，即使有优良遗传因子的单孢子也不能表现其特性。从蘑菇中分离出大量单孢子相当麻烦，但是可以从众多培养物中筛选出有新遗传性状的菌株。例如原基畸形的nr.59菌株，其能发育出子实体，但是无菌柄，类似马勃而不象伞菌；后来它的子实体形状又有变异。就把第一种类型称为59a，第二种类型称为59b。在栽培59b的菇箱中，长出了一种块状子实体，重350克，后经组织分离培养，获得第三种类型59c，其子实体重量最高达1800克，可以切片、油煎，做成美味的炸肉排配菜。但是采收过晚时内部变成棕色。此外，59c在其菌丝繁殖时很快退化成59b型。5克b的子实体形状呈白色马勃状，用其与产生正常棕色子实体的菌株杂交，在后代中出现了正常形状的白色子实体。
Fritsche还研究蘑菇属(Agaricus)的其它种，例如大肥菇(A.bitorquis)和野蘑菇 (A.aruensis)，成功地从大肥菇中选育出生产菌株Horst B30。大肥菇的优点是抗病毒病。此外，其与双孢蘑菇的重要区别是要求较高的出菇温度(约高5℃)。野蘑菇生长的牧草地里，形态特征是菌幕类似嵌齿轮，要求比双孢蘑菇低3℃左右的栽培温度。
（一）双孢蘑菇育种 荷兰菇业的发展促进了双孢蘑菇的杂交育种研究。1975年前后荷兰开始用机械采菇，当时只有应用米色菌株才能适应收割机。但是制罐业抱怨这种蘑菇品质恶劣，例如同白色菌株对比，米色菌株的菇体在加工后失重较多，菌盖不太白。因此，制成的罐头外观欠佳，制罐业要求Horst试验站通过杂交育种，结合白色和米色菌株的优良性状。
双孢蘑菇偶然会出现自身不育的单核担孢子或同核体担孢子，这类菌丝的生长比异核体的慢得多。两株同核体是否能亲和相配，在菌丝营养生长阶段表现不出来。因此必须测验其组合后产生子实体的能力。结果发现，作为对照的单孢子菌株不产生或极少产生子实体;但某些组合能产生大量子实体。因而，可以利用不育单孢菌株配对杂交，以恢复可育性为标记选育杂种。
从17对组合所产生的子实体上，分别采集孢子并分离出40个第一代（F1代）单孢菌株；经再次栽培出菇，又分离了680个第二代（F2代）单孢菌株，这些菌株再经栽培，从中筛选优良的新品种。经过6年的努力，于1981年选育出纯白色蘑菇和米色蘑菇的杂交品种Ul和U3。
U1和U3结合了白色和米色亲本的性状，如U1菇体兼有白色亲本的圆形菌盖和米色亲本较大的外形；U1的菌盖光滑象白色亲本，在不良条件下也会有少许鳞片，但因呈白色而不易察觉。其米色亲本菌盖表面有棕色鳞片。
U3也有白色亲本的白而平滑的菌盖，而粗菌柄象其米色亲本。此外，U3对覆土类型反应强烈，用干燥轻质覆土，菇体小；用湿重覆土，则菇体大。
U1和U3杂交种在欧洲各国广泛栽培几年之后，发现Ul菌株发生了变异，如菌盖趋于扁平，柄和盖的连接处产生空心使菇盖易于脱落，单产明显下降等。为了使Ul复壮，Horst试验站作了很多努力，Fritsche到1986退休前，几乎都为了这个问题而工作，曾经采取以下措施:
①使用两个原始的同核菌株配对，产生新的异核体菌种，沿用Ul菌号投放市场。但未获得理想的重建异核体。
②使用原生质体克隆Ul，再生菌株硬开伞而低产。
③在子三代中分离单孢菌株，筛选出了有希望取代Ul的新菌株。
有学者指出，Ul菌株的育成和改良有以下几个问题:
①配对育种依靠机率，以出菇对比为筛选的唯一手段，成功率低；虽进行了各种“复壮”试验，但效果甚微。
②Ul菌株是米色蘑菇与白色蘑菇的两个同核体配对而得的异核体(F1)，其所含的两个异源核末曾经过核配，因此F1代用于出菇可能不稳定。
③尽管使用原始的两个同核体配对重建新的异核体，这不能视为Ul的复壮，也不应该沿用Ul菌号。
（二）大肥菇育种 不同的野生菌株，其产质量有很大差异。例如1号菌株的子实体具有大肥菇典型的外形特征，菌柄粗短，菌盘平坦且有小凹陷。6号菌株的子实体菌柄较长，菌盖较隆起。两者相比后者较好，因为菌柄太短容易沾土，并且不易采收。菌盖凹陷则外观不好。
为了获得担孢子，把清洁的子实体(具有薄而未破的菌幕)置于培养皿中的金属丝上，用玻罩盖好。器皿需事先在15O℃消毒2小时。大约3天后孢子散出，孢子印在冰箱中贮藏。为了进行单孢子培养，用灭菌蒸馏水制成孢子悬浮液，稀释数倍后把少量悬浮液与琼脂培养基混合，倒进培养皿中进行培养。大约10天后，挑取有可能是单孢子发育而成的小菌落，转移到试管斜面再培养。大肥菇的单孢子菌株，其菌丝生长属于紧贴型。
下一步工作是将单孢子菌株相互交配，生产异核菌丝体，然后进行选择性栽培，这是最费时间的工作。子实体大小、形状、颜色、鳞片和其它性状不但受遗传基因的控制，也受环境条件的影响，因而需要有经验的研究者进行细致的观查比较，才有可能选育出与亲本不同的新菌株。初筛是将菌株播种于0.07㎡的小菇箱里，内铺2.5公斤经后发酵的培养料；复筛再将初筛选出的菌株播种于0.2㎡的菇箱中进行测试；之后在1.3㎡的小区中重复2次；最后在6㎡小区中测试。
最好的菌株接照瓦格宁根Sprenger研究所的制罐品质标准检验，参加评定的还有技术专家和销售部门的人员。通过上述关口，一旦选出最佳菌株，就扩大播种面积，在菇场中进行生产水平的比较鉴定，确认是优良菌株后申请专利。
1975年，第一批大肥菇杂交种Horst k26和k32进入市场，Darmycel公司用Horst试验站这两个已获得专利权的菌种进行大规模商业生产。
采用Eger(1962)的半皿测试法，检测k26和k32菌株生长情况的差异。把培养皿放在相同条件之下，k26的菌丝生长旺盛。在栽培室中，这两个K系菌株表现出与培养皿里一样的差异。K26很容易长入覆土层，从基质长出后几乎布满覆土表层，需大量通风才能产生原基;而k32的菌丝则需较长时间才能长透覆土层，如果过早通入新鲜空气，原基就会发生在覆土层的深处。因此，Horst k26比k32容易发菌生长，而后者容易出菇。此外，K26的菌柄基部宽，k32的逐渐变细。K32的子实体容易采收，废弃物少。K26和k32的杂交组合为Horst k46，该菌株在澳大利亚广泛栽培。
（三）野蘑菇育种 这是1975年的事。选育野蘑菇的动机来自罐头厂的经理们，他们经常从牧草地上采集到野蘑菇，菇体的颜色从近白色到深黄，有强烈的茴香味，这是野蘑菇的特点，消费者愿意为这种特殊风味付出高价。经理们要求Horst试验站探讨野蘑菇的栽培方法。
1978年微生学家Bas开始执行蘑菇属（Agaricus）各个种的分类研究计划。在4年中，他从采集的野蘑菇子实体上分离出46个组织培养物。Horst试验站获赠这些野生种质资源后，即对各菌株进行栽培试验。在18～2O℃的0.07㎡菇箱中，46个菌株中的大多数产生的菇体不超过10个，有的能产生20个以上的菇体，其中最好的一个菌株产生了40个菇体，以后对此高产菌株进行了重点栽培。
栽培野蘑菇的一个大问题是其菌丝在培养料中生长缓慢，但在麦芽汁琼培养基上其菌丝生长得快。这是否与pH高低有关呢？在铺有不同pH琼脂培养基的平皿中央接种，约2周后测定菌落直径，发现在pH5.0～5.6时菌丝生长最好。于是，在27㎏堆肥中加过磷酸钙(含46%P205)使之pH下降，接种后置于0.27㎡菇箱中发菌，覆土后保持18～20℃，第5～6周采菇记产量。结果表明，以加1%过磷酸钙的培养料产菇量最高，接种时pH约为6.5，对照培养料为7.5；加2%过磷酸钙的培养料(pH6.3)产菇量显著降低。但是，pH最低时菌丝生长的并不差。
出菇期间的最后2个星期，将菇箱从18～2O℃和l5～16℃的两个栽培室合并到18～2O℃的栽培室，3个菌株对温度的反应不同：源自野生菇arv.21的2个菌株在较低温度下产量最高；而源自野生菇arv.34的1个菌株在较高温度时产量最高。在6周的采菇期内，最高产量超过9kg/㎡；某些菇箱延长采收期5周，一共采收11周，产量接近15kg/㎡。这一产量与双孢蘑菇相比虽说不高，但却显示了野蘑菇用于生产的希望。因为在50年前，双孢蘑菇在9周的采收期内仅能产菇6～1Okg/㎡。
    三、我国的蘑菇育种成就
福建省蘑菇菌种研究推广站采用同工酶电泳法，分析蘑菇菌株间的亲缘关系及预测蘑菇杂交菌株的特性，建立了一套行之有效的酯酶同工酶(EST)检测技术，获得了蘑菇杂交育种的重大成就。例如蘑菇杂交菌株As2796，在福建省栽培面积占90%以上，在全国已推广2亿多平方米，产菇近200万吨。
1989年，福建省蘑菇菌种研究推广站的科研人员应用6种同工酶检测了蘑菇的3种典型栽培菌株，即高产菌株(H)、优质菌株(G)、中间型菌株(HG)单孢子分离物的同工酶电泳表型，结果发现既有亲本类型又有变异类型，但基本局限在H、G、HG和S(不育)四大类型中，变异发生的方向和程度主要受菌株遗传特性的影响，也受菌株生理状态或所处环境条件的影响。变异的趋势是H→HG→G。伴随着同工酶表型的变异，变异株的生长类型、栽培性状及子实体质量也发生变化。试验表明，H型(米色，高产)同核不育株(Hs)与G型(白色，优质)同核不育株(Gs)配对杂交，获得G1-5、HG1-2、HG4、HG 5等异核体，其中只有HG4和HG5呈典型杂合体（暂定为F1），荷兰的Ul杂交菌株即属于HG4型。从HG4和HG5所结菇体上分离的单孢子二代（F2）中，几乎包括所有传统菌株类型(H，HG，G)与多种重组类型(HG6～HGl7)、同核不育型(Hs，HGs，Gs)和杂合类型(HG4，HG5)。子一代的HG4型和HG5型以及子二代的HG4型和HG5型杂交菌株均可表现出亲本的一些性状，是杂交育种所希望的目标菌株，蘑菇杂交菌株As2796就是从HG4型杂交子二代中选育出来的，其杂交育种程序如下：

程序1 酯酶同工酶标记的杂交育种

种质收集
↓
同工酶电泳分析菌株亲源关系
↓
遗传相似值小且具优良性状的菌株
↙ ↘
H型菌株 G型或HG1-2型菌株
↓ 同工酶检测 ↓
Hs型不育单孢株 G型或HGs型不育单孢株
↘ ↙
配对培养
↓
双亲本接合区分离物
↓
尖端菌丝
↓
同工酶鉴定HGx杂合体（F1）
↓
出菇试验
↓
分离孢子（F2）筛选目的菌株

程序2 优良品种As2796的育成

亲本02 亲本8213
↓ 单孢分离与同工酶检测 ↓
361-2(HS型)不育单孢 As165 (GS型)不育单孢
↘ ↙
W95-2杂种一代（HG4型）
↓同工酶检测、出菇试验、单孢分离
As2796 杂种二代（HG4型）

将上述杂交育种程序详述如下：
（一）种质收集 栽培的双孢蘑菇菌株起源于法国，先传到北美，然后扩散到世界各地。杂交育种所用的亲本应该有些遗传距离，即遗传相似性越小越有可能产生优势互补。否则很难获得具有杂种优势的优良子代。因此需要广泛地收集种质资源，包括栽培菌株和野生菌株，建立种质库乃至构建基因文库，这对于蘑菇的杂交育种是至关重要的。据报道，法国和美国加州已分离并利用了野生双孢蘑菇菌株，我国（王波，2002）在西藏地区高原草甸上也分离到了野生双孢蘑菇。
为了充分收集、利用极其有限的双孢蘑菇种质资源，Kerrigan博士于1988年发起了全球性收集鉴定蘑菇种质的计划，获得了各国的响应。收集来的蘑菇种质材料可以是孢子或子实体组织分离培养物，采用多种方法予以保藏。蘑菇种质类型的叫法多样，有分为栽培菌株与野生菌株的，有分为双孢菌株和四孢菌株的，有分为棕色菌株、浅棕色菌株、奶油色菌株、米色菌株和白色菌株的，也有的分为匍匐型菌株、气生型菌株和中间型菌株。蘑菇种质的鉴定可以采用同工酶电泳、DNA的限制性片断长度多态性（RFLP）分析、随机扩增多态DNA（RAPD）标记分析等，也可以用聚类统计方法分析菌株间的遗传相似性及种群间存在的遗传差异性（参见图3-8）。
（二）菌株类型 经过长期的人工栽培，人们对双孢蘑菇的种性有了较多的了解。福建省轻工业研究所根据双孢蘑菇栽培特性、鲜菇质量和罐藏加工等差异，把蘑菇菌株大致分为高产类型、易褐变类型、中产类型、优质类型和不育类型(表3-1)。

表3-1 蘑菇不同类型菌株的特性
特点类型 单产与菇潮 菌盖与菌柄 菌褶与颜色 罐藏质量评价
高产型 出菇早，较高产 扁平凹顶，有鳞片，柄髓软 较宽大，褐色或红褐色 组织松软，色灰暗，菌柄空心，高收缩率
优质型 出菇迟，较低产 圆滑，柄短，致密，无鳞片 较窄小，肉色或淡粉色 组织致密，色淡黄，风味好，低收缩率
中间型 结菇早，产量中等 盖圆光滑，柄中等粗 浅褐色或粉红色 组织密度及收缩率中等，色泽淡黄或土黄
易褐型 结菇早，非常高产 厚而圆，中等致密，柄直细 较宽大，褐色且蔓延 深灰色，收缩率高，罐藏质量差
不育型 菌丝生长缓慢，细弱，不结菇

一个新分离或新杂交培育的菌株，能否结菇?质量怎样?是否高产?以前只能靠多次、大量的栽培试验来比较筛选目的菌株，因而工作量大、周期长、费用高且不方便。如果能在实验室早期从分子水平找到可以用于预测新菌株生产性状的指标，将大大减轻筛选压力，提高选育种的工作效率。
酶是基因的直接产物，又是性状表现的调控者，特性明显不同的蘑菇菌株之间在某些同工酶遗传基础上存在着差异，因而可以将酯酶同工酶电泳带型作为菌株特性鉴定和育种检验的指标。以同工酶电泳区带的迁移率(Rm)为依据，可以分析比较蘑菇种质的同工酶类型差异、推定基因型变异。把表型完全一致的菌株归于同一基因类群，两个基因类群间的遗传相似程度值S=NS/NS+ND，式中NS代表Rm值相同的酶区带数，ND代表Rm值不同的酶区带数。当比较的酶多于一种时，取各遗传相似值的平均数作为二基因类群间的总遗传相似值，基因类群间的遗传相似程度系统树的计算与绘制用类平均聚类法，把遗传相似值最相近的基因类群组合成新类群，再计算该类群与其他类群间新的遗传相似值，进一步把最相似的类群组合在一起，直到所有类群配成一个家系为止。以系统树反映菌株间的种内亲缘关系。
福建省蘑菇菌种研究推广站采用此技术，对150个从国内外收集的各类型菌株作了酯酶同工酶电泳检测分析，把有规律的特定区带定为标记区带，把具相同标记区带的同工酶类型归于同一大类型，再和菌株栽培表现类型相比较，发现同工酶电泳表型与菌株特性表型存在着相关性(表3-2)。
表3-2 蘑菇菌株特性和酯酶同工酶电泳带型
菌株类型 高产型 优质型 中间型 易褐型 不育型
同工酶带型 H型 G型 HG1-2型 H2型 S型

（三）不育株的分离与鉴定 分离同核不育单孢菌株常用的方法为：①从四孢变种的子实体上分离单孢培养物。②从正常双孢菇上取群体孢子，做成稀释悬浮液，涂平皿培养，挑选生长相对较弱的小菌落，其有可能是不育单孢的培养物。③由于双孢蘑菇的担孢子绝大多数为双核，难于得到杂交需要的单核体，但是原生质体单核化技术使这一困难迎刃而解。这是因为双核原生质体再生而发育成菌落的时间显著短于单核体，再生平皿上先出现的大型菌落基本为双核体，出现较迟的小型菌落一般为单核体(图版18)。
菌落再生时间的先后是鉴别双核体与单核体的关键。有些研究者未能从再生的原生质体中分离出单核原生质体的原因，恐怕是没有掌握它们的再生时间不同这一重要规律。为了避免双核体与单核体的原生质体混合生长，应将早期再生的较大菌落移走，为后来再生的单核体菌落生长留出空间。
原生质体单核化技术提供了一种从异核体中分离两个不同单核株的途径。这种技术与常规的单孢分离法相比有两个优点: 一是不需要子实体而缩短了分离单核体的周期;二是单核体未经减数分裂，其基因型不发生分离，有利于保存亲本的遗传特性。例如，某亲本双核体的交配型组合为AxBx+AyBy，经过结实过程中的减数分裂，则可产生四种交配型的单核体，即AxBx、AyBy、AyBx、AxBy，结果是稀释了亲本基因型。而采用原生质体单核化技术，可以重新获得两种亲本基因型AxBx、AyBy。可以认为，用原生质体再生法获得的同核不育株是无性繁殖的产物，不发生变异，可直接用于配对杂交。
福建省蘑菇菌种研究推广站(1990)采用上述第（2）种方法，从14个异核亲本中共分离出2578个单孢培养物，其中生长弱慢的有374株，占l4.5%，再经同工酶电泳鉴定，有158株为S型（不育型），占单孢分离物的6.1%。栽培试验表明，大多数S型培养物在堆肥中生长很弱或基本不生长，即使生长了也末见结菇。酯酶同工酶电泳表明，这些不育菌株的同工酶均表现为一些电泳区带的缺失，这与用DNA的RFLP及RAPD鉴定的研究结果一致。
（四）配对及杂合子鉴定 按杂交育种的通用原理，配对杂交要选择遗传相似值小，具有相对优良性状和不同遗传标记的菌株进行组合。据报道(王泽生，l990)，配对杂交效率受培养基成分的影响，即同一配对组合在不同培养基上配对可表现为亲和，也可表现为不亲和(表3-3)。
表3-3 不同培养基对同核体配对杂交亲和性的影响
培养基配对组合 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
A（73-1×21-2） 5- 2- 1- 1-
B（386-9×156-3） 5+ 0- 0- 1-
C（388-5×165） 4+ 0- 0- 1-
D（388-5×93-4） 3+ 1- 0- 1-
注：①培养基Ⅰ～Ⅳ分别为麸皮培养基、PDA、PDA+10%啤酒、
PDA+0.1%烟酸。②1～5表示菌丝的生长速率由小到大，“0”代
表形成拮抗性。③“+”表示同工酶鉴定显示已杂交亲和，“-”
代表不亲合

上表数据表明，麸皮培养基最佳，菌丝生长速率都快于其它培养基，而且发生杂交的比例也高的多。这说明各组合的亲和性不但受性因子控制，也受培养基成份的影响，麸皮培养基或蘑菇堆肥培养基适用于配对杂交。对于不易发生杂交的组合，可能是亲源关系较远。
通常把配对组合的培养物成对地接种在培养基上，凡两培养物间不形成拮抗线，则此组合可能是遗传亲和的。从其菌丝融合区域分离3个菌丝块，转移到新鲜培养基上培养lO天左右，对生长快的分离物，在无菌条件下用显微操作器上的微型打孔器分离菌丝尖端扩大培养。约有250个配对组合发生了可能亲和的现象，从互相作用区域分离出750个菌丝块，经菌丝尖端分离扩增后进行同工酶鉴定，有175个组合产生了具有双亲杂合酶谱的异核体杂种F1。经栽培试验，有84个组合产生的杂种F1恢复了结菇能力并产担生孢子，对这些担孢子进行单孢分离，获得了重组体F2。
同核体亲本H1、H2、Hs1、Gs2；异核体亲本G1、HG2；杂合体菌种（F1）HG4、HG5的酯酶同工酶(Est)聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（王泽生，2000）参见图3-9。

图3-9 酯酶同工酶电泳图谱
（五）同工酶检测技术 所谓同工酶，是指能催化相同生化反应而结构及理化性质不同的酶分子。1959年，Market用电泳分离法首次发现了动物的乳酸脱氢酶具有多种分子形式，并将其称为"isoenzyme"或"isozyne"，即同工酶。至今已发现了数百种具不同分子形式的同工酶。
检测同工酶的技术，最广泛采用的是凝胶电泳法，有聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)系统，琼脂糖凝胶电泳(AGE)系统和淀粉凝胶电泳系统等等。电泳方式有卧式平板、垂直柱状和垂直平板等等。按电泳性质又有不连续系统、SDS系统、等电聚焦系统等。电泳是利用同工酶具有不同的分子结构、氨基酸序列或组成有差异而引起酶分子带电，分子形状、大小等差异，使同工酶在同一电泳系统中具有不同的电荷或不同的电荷数。又经过凝胶分子筛的过滤(不连续系统还有浓缩效应)，从而分离成迁移率(Rm值)不同的区带，经过组织化学染色等，显示出酶谱。酶谱可制成干片归档，亦可拍照保存。酶谱的定性分析可通过Rm值测量比较进行，利用薄层色谱扫描仪如CS-930双波长薄层扫描仪等，能对酶谱进行定性和定量的自动分析处理。
因为同工酶是基因的直接产物，主要是由不同等位基因或不同基因位点编码的，同工酶的电泳表型是基因型的反映。因此，它不仅是生理生化的指标，而且是可靠的遗传标记。可以成功地区分种一级分类单位，也可鉴定未知真菌。以蘑菇为材料研究或应用过的同工酶类有数十种，其中应用最广泛的有酯酶（EST）、乙醇脱氢酶(ADH)、多酚氧化酶(PO)、过氧化物酶(POD)、肽酶(PEP)等。
同工酶鉴定技术一般包括3个步骤：即样品提取、凝胶电泳和染色观察：
1．样品制备 供试菌株接种于PDA培养基斜面上，22～25℃培养15～20天，取出用接种刀刮下菌丝，按1:3:0.5的比例混合菌丝、0.1m磷酸缓冲液和石英砂，置冰浴中研磨成匀浆，4000～lO000转/分离心2O分取上清液，按5:l:1的比例混合上清液、40%蔗糖和0.01%溴酚蓝溶液，作为电泳样品置冰箱备用。子实体取制罐用鲜菇的盖或褶组织5～10克冰浴研磨成匀浆，以下同菌丝制作。
2．电泳 这里主要介绍常用的聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳(PAGE)。其最大优点在于可以通过选择单体浓度或单体与交联剂的比例，而得到不同孔径的凝胶，以适合于分离不同分子量、不同结构的酶蛋白。应用中多采用不连续电泳，即通过浓缩胶的浓缩效应和分离胶的筛分效应，将同工酶分成一条一条的狭窄的区带。分辨率比琼脂糖凝胶、淀粉凝胶高。
（1）分离胶制备 备好洗涤干净的垂直板状电泳槽，装好胶模，然后制备分离胶。用pH8.9Tris-HCl缓冲液加上Acr-Bis液，TEMED，蒸馏水混匀，再加10%过硫酸铵，迅速摇匀，灌胶，并用蒸馏水封住胶面，静置聚合。待聚合完全后，倾出胶体上端的水层，用细滤纸条吸干胶层上的残余水迹。分离胶的浓度以9%为宜。
（2）浓缩胶制备 用pH6.7Tris-HCl缓冲液加上Acr-Bis液，TEMED，蒸馏水，再加10%过硫酸铵(或4%核黄素)即摇匀，灌胶于已聚合好的分离胶上，插入样品模卡，静置聚合(加4%核黄素要经光照聚合)。
（3）装槽点样 拆去样品模卡，装槽，注入电泳缓冲液(pH8.3吨ris-甘氨酸)，每个样品孔点样75微升。
（3）电泳 电泳槽置于3℃下l20V电泳2Omin后稳压4h左右，在溴酚蓝指示带离底部1cm时停止电泳。
3．染色观察 拆下电泳板块，用蒸馏水边淋洗边转移板状凝胶于染色盘中，倾去蒸馏水，加染色液染色。不同的同工酶的染色配方不同，有的对温度、光照等因素还有特别要求，可查阅有关文献。
    第四节 原生质体融合育种
原生质体融合育种技术有三方面的优点：第一，通过原生质体再生，可以较快速地获得同核菌株用于杂交。这种菌株是无性操作的产物，在遗传上比有性生殖产生的同核菌株更接近于亲本。第二，细胞壁不亲和的配对杂交组合或亲缘关系相近的蘑菇种间，比如蘑菇与大肥菇，可以通过去壁产生原生质体，融合而实现杂交。第三，原生质体还可以作为外源基因的受体。有关方法介绍如下：
    一、原生质体制备
把蘑菇的菌丝体、子实体组织或孢子置于适合的溶壁酶液中，在适宜的温度、pH条件下，经一定时间的酶解，降解掉细胞壁后即可游离出由细胞膜包围的球状体，即原生质体。失去细胞壁保护的原生质体对渗透压敏感，低渗透压条件下易破裂。因此，原生质体形成率受制备材料的类型与生理状态、溶壁酶类型与浓度、溶壁酶液的稳渗剂成分、浓度、pH、酶解温度及时间等因素的影响。选择适宜的条件是制备大量高活力、易再生的原生质体的关键。
以菌丝体为材料制备蘑菇原生质体包括:菌丝培养、原生质体制备、分离、纯化与镜检几个步骤。首先，把蘑菇菌丝块接种于装有液体完全培养基的三角瓶中，在24℃下静置培养5～lO天，把菌丝体取出沥干，并用0.6mol氯化钾溶液冲洗2遍，用滤纸吸干。按0.5克鲜重菌丝加l毫升溶壁酶的比例混合，在24℃下溶解2～6小时，定时取样镜检，并用血球计数板计算原生质体形成率。当形成率达107个/毫升左右时进行提纯。原生质体悬液经无菌脱脂棉或玻璃棉丝过滤。滤液经每分钟1500转离心lO分钟，弃上清液，沉淀下来的原生质体用等量稳渗液稀释，可重复离心一次，即得原生质体精制悬液。原生质体的去壁情况可以加入萤光增白剂等予以检验(壁成分可染上色)，也可以用低渗处理检验原生质体的破裂情况来初步判定去壁效果。原生质体活力检验可以加0.1%中性红染色，染上者为失活。
有关研究探讨了菌龄、溶壁酶、稳渗剂和酶解条件对原生质体形成的影响。
（一）菌丝菌龄 使用不同菌龄的菌丝制备原生质体的结果差异很大。菌龄太小，生成的菌丝量少，形成率低。菌龄过大，形成的原生质体少而且变形的多，有时甚至只产生菌丝碎片。以培养5～7天的菌丝制备的原生质体形成率高，活力大，耐精制提纯。
（二）溶壁酶 单一酶对蘑菇菌丝体去壁的作用不明显，多酶混合液的作用亦不理想。目前有效的均为木霉产生的酶系。我国广东省微生物所生产的溶壁酶，丹麦产的Novozymo234酶等均属此类，但效果仍然有别。据报道，复合酶系中若含过量的蛋白水解酶等会破坏细胞膜结构而降低原生质体活力，并影响到再生。
（三）稳渗剂 稳渗剂分无机和有机两大类，不同的稳渗剂对原生质体形成率影响很大，常用的0.6mol氯化钾，效果较好。
（四）酶解条件 适宜的条件是使溶壁酶处于最佳活力状态。由于加入的溶壁酶量大，故pH多保持自然，约5.6左右。温度偏低时，原生质体形成慢，反之快。但温度偏高时，原生质体极易破裂，形成率反而下降，蘑菇以24℃为宜。酶解时间以2～4小时左右形成率高。时间短，形成率低，时间太长，原生质体也易产生变形，活力下降，甚至破裂，形成率亦不高。推测酶解温度太高或时间太长均易破坏原生质体的膜结构，导致变形、破裂。
蘑菇菌丝体酶解后，原生质体的释放不同步且形式多种。在显微镜下观察酶解时，菌丝体发生了质壁分离，其内含物剧烈收缩形成明显的边界，随着细胞质的流动逐渐从菌丝尖端或侧面释放出来，也有从菌丝片段断面释放出来，呈圆球状(图版19)。
原生质体大小相差较大(4～16微米)，尤其菌丝的菌龄较大时。偏大的原生质体多合大液泡，偏小的多呈透明状。无离子水低渗处理后，透明状的原生质体总是最先破裂，其次为含大液泡的原生质体，中等大小(8微米左右)且内含物较多的原生质体可以膨大数倍于原来的直径后才破裂。中性红染色时，中等大小的原生质体不易染上，表现出较强的活力。推测偏小的原生质体缺少细胞核或细胞内含物不完整，而偏大且含大液泡的原生质体可能是已 发生某种不利的生理变化的结果。
综上所述，以菌丝体为材料制备蘑菇原生质体的适宜条件是取幼龄(5～7天)菌丝体加入0.6 mol氯化钾配制的l.5%溶壁酶(广东省微生物所产)，PH5～6，于24℃下酶解2～4小时左右，原生质体形成率可达2.4×l07个/毫升。原生质体大小较均匀，活力高。
    二、原生质体再生
对蘑菇的原生质体融合育种来讲，重要的一环是必须使原生质体再生成具细胞壁的菌丝细胞。这样，才能对产生的同核体或融合子进行遗传鉴别，筛选与利用。原生质体再生培养有液体和固体培养两种形式。一般食用菌多用固体培养基加上原生质体包埋(双层法)效果较理想，常用2%琼脂作包埋剂，蘑菇原生质体再生也可用此法。
（一）再生率 将精制提纯的蘑菇原生质体制成悬液，原生质体浓度约为1×105个/毫升，取O.5毫升加于液体再生培养基中培养(A)，另取同量原生质体样品加3倍无离子水稀释后加入同一种再生培养基中培养(B)，分别在24℃下培养，定时取样镜检再生效果，按下式计算再生率：

A中原生质体出芽数－B中原生质体出芽数
再生率＝━━━━━━━━━━━━━━━━━×100
O.5毫升悬液中的原生质体数

取适量液体再生培养12～24h的原生质体悬液涂布于固体再生培养基上继续培养10～20天，当显微镜下观察到原生质体克隆再生成小菌落，但尚未与其他克隆相连接时即用微型打孔器显微操作分离。可用菌丝生长速率、菌落形态、同工酶或核酸电泳等指标分析再生结果。
蘑菇原生质体的再生受到再生培养基成分、稳渗剂种类与浓度、培养温度等因素的影响，甚至和制备时用的溶壁酶种类与浓度、酶解时间与温度条件等均有关系。有些溶壁酶系含有较多的蛋白水解酶，能破坏细胞膜结构而影响再生。酶解时间长或温度高虽然可以在一定程度上提高形成率，但原生质体活力受到影响，有些产生变形，甚至破裂，不利于再生。
蘑菇在常用的食用菌原生质体再生培养基上难以再生细胞壁，而在含蘑菇堆肥成分的培养基上能获得5%左右的再生率(王泽生等，l990)。这表明蘑菇的细胞壁成分或结构与其他食用菌有较大差别，还表明蘑菇堆肥中含有适于蘑菇再生细胞壁的某种成分。
原生质体于液体再生培养基上培养12～24小时萌发出芽管后再涂布于固体再生培养基上培养，比直接涂布培养更早出现肉眼可见的小菌落，这可能是液体培养状态更适于原生质体萌发出芽管的缘故。
不同的稳渗剂成分明显影响再生率，还影响原生质体再生的形态，不适宜的稳渗剂导致原生质体呈球状分裂，甚至不再生出菌丝体。原生质体再生过程的显微观察结果表明，在液体或固体再生培养基上的再生形式相似。
再生不同步，快的20小时后即萌发出芽管，24小时长成菌丝，有的已分枝成小菌落状，慢的24小时后才萌发出芽管。原生质体再生的形态多种，有的萌发出芽管即长成菌丝（图版20），有的先分裂出一个近球状的细胞，由此再分出芽管、菌丝，也有的分裂成串珠状。当培养基成分，尤其是稳渗剂适宜时，再生形式以前两种为主。部分原生质体会不断膨大，胞内液泡也随之增大，尤其是稳渗剂不适时常发生。未见这种原生质体再生，时间延长多破裂。
应用同工酶或核酸电泳技术分析，可以发现一些蘑菇异核菌株原生质体的再生株是单核或同核体（Castle等，1987;Sonnenberg等，1988）。再生菌株的酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳表型大多与亲本相同（王泽生等1990)，属于异核体可育株，少部分再生株有区带缺失表现，与随机分离单孢子获得的同核体不育株的电泳表型相似。而且，再生的同核体与单孢子分离的同核体在生长速率与菌落形态上也有相同特点，即生长缓慢，菌落形态与正常的异核体菌株有较明显差异。这表明可以通过菌丝原生质体再生法获得同核体株用于常规杂交，而不必担心从担孢子分离的同核体因经历了减数分裂而可能发生某种遗传变异，或丢失亲本的某些优良基因。此法不必通过栽培收获孢子，因而又比用单孢子分离筛选同核体更快速、简便。但也有报道，经过原生质体再生的菌株由于曾经受过剧烈的环境压力(去壁过程等)而在菌丝生长或栽培中表现出某种不良性状(Fritsche,l991)。用原生质体再生法获得蘑菇同核体的频率一般为10%左右，高的可达30%。
综上所述，蘑菇原生质体再生的较适宜条件是在0.6moL蔗糖的堆肥培养基上于24℃下培养10～2O天。液体再生培养预培养后再涂布于固体培养基上能加快再生菌丝生长，再生率可达5%左右。
堆肥培养基配方为: 堆肥75克（用浸汁），磷酸二氢钾（KH2PO4）2.0克，蔗糖20克,蛋白胨2克，硫酸镁（MgSO4 5H2O）0.5克，VB1O.5克，细胞壁制剂200毫升，水800毫升，pH自然。制固体平皿时加琼脂20克。
细胞壁制剂:称取静置液体培养的蘑菇菌丝体40克，用0.6moL稳渗液洗涤1～2次，加500毫升pH4的0.lmol磷酸缓冲液，12O℃灭菌30分钟，浓缩至300毫升，匀浆后，每分钟4000转离心，可获细胞壁制剂约200毫升。
    三、原生质体融合
在蘑菇的不育株的配对中，有大约50%的组合因为细胞壁不亲和而无法杂交。而且与其他食用菌相比，蘑菇的种质资源显得十分贫乏，与亲缘关系相近的蘑菇种，比如大肥菇杂交也存在不亲和的问题，应用原生质体融合技术可以克服这些障碍。
常用的食用菌原生质体融合方法有化学融合法和电融合法。检出融合子常用的标记有生态学与形态学标记，有抗性或营缺型、同工酶或核酸电泳等遗传标记。
采用含CaCl2的30%的聚乙二醇(PEG4000)，pH8.5作为融合剂进行蘑菇原生质体融合。融合子经过0.6mol甘露醇洗涤以去除PEG毒性后，置于再生培养基培养l0～2O天，把肉眼可见的小再生菌落分别移至新鲜的PDA培养基继续培养，凡菌丝生长速率恢复正常的分离株均选出作同工酶检测。用酯酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化物酶和乙醇脱氢酶同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测融合子。凡电泳表型表现出杂合的或互补型的分离株被鉴定为融合株。
融合率%=融合株数/加入的原生质体数×100%
试验结果表明，蘑菇原生质体在不同浓度的PEG-Ca2+系统中的凝聚速度不同。例如，当用30%PEG时，Ca2+浓度太小，凝聚速度较慢;浓度太大，速度快而且成堆结团。一般用0.O2mol的CaCl2较好，原生质体融合率可达lO-5～10-6。同一亲本或不同亲本的原生质体融合子在堆肥培养基上均可再生。但是，通常只有不同亲本的原生质体融合成的异核体杂种才可能恢复正常的生长速率。从再生培养l5天左右的平皿上挑取的单菌落多属此类型。同工酶电泳检测结果表明，有的融合株明显具有双亲的标记酶位点，有的呈某一异核亲本的表型。与可亲和的单核菌丝配对杂交产生的杂种子一代相比，同工酶表型更加多样，这可能是原生质体融合引起核基因组高频重组的结果。经栽培试验，结果表明并非所有的异核体融合株均恢复结菇能力，这种现象与可亲和组合单孢株杂交的结果类似。它暗示细胞壁的亲和性与结菇能力之间并无必然的关系，它们可能由不同的基因位点控制。恢复结菇能力的菌株，除部分子实体畸形外，多数正常。有的融合株明显结合了双亲的某些特点。
电融合技术对原生质体损伤小，融合频率高，还能利用原生质体进行外源目的基因或细胞质成分导入的研究，为蘑菇的远源杂交提供了一条可能的途径。例如，可采用电融合技术进行蘑菇与大肥菇的种间杂交，目标是培育出抗蘑菇病毒、耐高温又具蘑菇风味的新菌株。
    四、原生质体转化
蘑菇的原生质体育种呈现两大趋势，一是通过同核单孢的原生质体，在抗逆性较强或具有其他优良性状的野生株与“近乎纯种”的商业品种之间实现杂交，进而选出优良的生产用种。
另一趋势则是运用原生质体为DNA片段的受体细胞进行转化育种。事实上，转化比杂交可更直接地对蘑菇的基因组进行改造，这种方法改进蘑菇农学性状的目的性、选择性更强。原生质体阳性转化，一般通过营养缺陷互补，表型互补或显性标记的方法进行选择。但蘑菇的营养缺陷型突变株很难获得，而且突变菌株由于生理上的缺陷，生长缓慢，培养困难。因此，以抗药性作为显性标记是转化实验中较为可行的方法。外源DNA片段导入原生质体的手段包括：PEG/CaCl2介导;LiCl介导，但该法的转化效率不如PEG/CaCl2介导法；电转化;用基因枪将DNA直接射入原生质体。
Sorthern分析和亚克隆试验表明，大多数丝状真菌的转化为整合转化，而且转化DNA整合不需要广泛的序列同源性。整合有同源重组和非同源重组两种类型。然而在蘑菇中，正如以往的研究发现的，重组行为极少在该物种中发生，无论是核基因组还是线粒体基因组。因此，20世纪90年代初期进行的蘑菇原生质体转化实验鲜有成功的报道。当然，当时这方面的转化技术尚不完善，采用的是效率相对较低的PEG/CaCl2DNA片段介导法，而且连接大肠杆菌的抗潮霉素转化载体的pAN7启动子是来自非蘑菇属的曲霉。
到了90年代中期，荷兰的Van de Rhee的努力使原生质体转化研究有了较大进展。虽然转化子选择标记仍以潮霉素(hygromycin)抗性作标记，但此时的转化载体已有了蘑菇的启动子Abgpd2，终止子为pA2H或pA2H-tl，转化方法改用电转化，载体在转化前用单切酶切成线状，提高了转化的效率。Van de Rhee 等人还曾尝试将造成蘑菇褐变的酪氨酸基因的反义DNA序列与潮霉素抗性基因进行共转化，以期抑制子实体中酪氨酸酶的活性，达到保鲜的目的。结果在转化株的子实体中用探针仍可检测到稳定存在的导入DNA片段。
一个有价值的蘑菇的转化株的获得必然包括三个技术环节：外源DNA片段的成功导入;该片段在受体细胞中的稳定表达;以及该基因控制的性状在子代中的稳定遗传。但目前为止，外源DNA在受体细胞中的稳定表达还很难做到，而且克隆到的直接控制蘑菇表型性状的目的基因为数甚微。因此，蘑菇的原生质体转化育种研究仍有许多工作要做。
    第五节 诱变育种
由于蘑菇的有性生殖属于次级同宗配合类型，其遗传保守性使得蘑菇天然发生杂交的机率非常小。因此，变异的另一来源是人为制造突变或重组来打破蘑菇的遗传保守性，是改良蘑菇品种的关键。德国真菌学家Esser曾提出“协调育种”的技术路线。其主要内容有三个:第一要有基因突变;第二是基因重组;第三是综合筛选。突变和重组可以使物种产生变异，综合筛选才能获得高产、优质、适应性强的目的菌株。
育种原理和应用技术较为复杂亦很重要，对此方面的内容从实用角度进行介绍。突变可分为自发突变和诱发突变，前者指生物体自然发生的遗传变异，发生频率很低，真菌一般为l×10-6～8;后者是人工采用物理、化学方法处理生物体而诱发的遗传变异，优点是可显著提高突变频率，加快育种速度。
    一、物理诱变
蘑菇菌种选育的主要方法有两种。第一，通过比较筛选获得具有优良性状的菌株;第二，在菌株间进行杂交产生并利用新的变异。育种者的目标是要把控制重要商品性状的基因组合在一起，以获得既高产、优质又具抗性的商品菌株。
（一）紫外线 在育种实践中应用最方便最广泛的物理诱变因素是紫外线。这种光线的波长稍短于可见光中的紫光，波长范围从136～390纳米。它是一种非电离辐射，能使被照射物质分子或原子中内层电子提高能级，但并不获得或失去电子，所以不产生电离。 紫外线诱变的最佳波长范围是200～300纳米，其中又以260纳米左右最佳。之所以能引起杀菌或诱变，主要是由于遗传物质DNA吸收紫外线而受影响。一般15W低功率紫外灯放出的光谱较集中于260纳米，适用于进行诱变。如果用30W以上的高功率紫外灯，则放出的光谱较平均分散，所以，诱变效果反而不如低瓦灯好。
（二）诱变原理 紫外线的生物学效应主要在于它可引起DNA的变化。DNA强烈吸收紫外线，尤其是DNA链上的碱基对。对紫外线嘧啶比嘌呤敏感得多，几乎要敏感100倍。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链断裂、DNA分子内和分子间的交联、核酸与蛋自质的交联，胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及嘧啶二聚体的形成。特别是后者，实验证明，受紫外线照射的胸腺嘧啶溶液改变了原来对紫外线吸收的特征，实际上已形成了另一种产物，经元素分析、分子量测定、结晶形态分析和红外光谱分析，证明是胸腺嘧啶的二聚体。它的变化过程是两个胸腺嘧啶的双键先分别变为单键，在变成单键的碳原子之间的新键处相互连接，并在两个嘧啶环上相应的C5和C6原子间的C键处，形成处于两个胸腺嘧啶间的环状键(图3-10)。

图3-10 胸腺嘧啶二聚体的形成
胸腺嘧啶二聚体的形成有重要的生物学意义。前面已经谈过，当DNA复制时，双链须先变成单链，然后各自再与附近的碱基形成互补链，两链之间嘧啶二聚体的交联会阻碍双链的分开和复制。同侧链上相邻胸腺嘧啶二聚体的形成，会阻碍碱基的正常配对。在正常情况下，胸腺嘧啶应与腺嘌呤配对，但两个相邻胸腺嘧啶的连接就可能改变这种情况，足以破坏腺嘌呤的正常掺入。复制会在这一点上突然停止或错误的进行。如新生成的DNA单链改变了的碱基顺序，则在随后的复制过成中，已改变的DNA链仍以自身为模板进行复制，进而产生了一个在两条链上碱基顺序都有错误的分子，其后果是基因突变。
紫外线除造成DNA两条单链之间胸腺嘧啶二聚体的形成外，还导致DNA一条单链上相邻胸腺嘧啶的交联、胞嘧啶水合、氢键断裂、DNA链断裂等变化。
（三）光复活作用 光复活在自然界是一个比较普遍的现象，是生物细胞对紫外线损伤的一种修复功能。经紫外线照射后，蘑菇细胞有两种类型的光复活:一种是直接光复活，即经过可见光照射后大部分DNA损伤可以恢复，甚至看来己显示死亡的细胞也复活了。这种光复活作用是通过光激活酶而发生的，这种酶可以使胸腺嘧啶二聚体解开而重新成为单体，一种特异的酶制剂在蓝光下，可以打断DNA中的胸腺嘧啶二聚体达90%。
另一种复活称作间接光复活，也称为黑暗复活。其原因是细胞在黑暗中减慢了大分子合成过程，这样便有利于某些生物体产生恢复DNA损伤的酶，而这种酶的产生是不需要可见光的。该过程包括特殊的核酸酶把含有胸腺嘧啶二聚体的DNA双链变成单链、切断二聚体、修复、复制而形成新的DNA双螺旋。
光复活能力的强弱，不同的菌甚至同一种菌的不同品系都有差异。对于那些有光复活能力的菌，照射以后必须避免把孢子悬液放在长波紫外光和短波的可见光中。在实践中也可使用此原理，利用致死剂量的紫外光与日光(300W～500W)反复交替处理，以增加被处理菌的变异幅度。导致光复活的光谱范围各种菌也是不一样的，如大肠杆菌为375nm，灰色链霉菌为435nm。一般波长大于525nm影响就不大。所以照射后的操作可以在黄光或红光下进行(黄光波长535～585nm，橙光586～654nm，红光646～760nm)，并避光培养。
（四）诱变剂量 各种菌类对紫外线的敏感程度差异很大，可以相差成千上万倍。例如，有一种抗辐射的小球菌(Micrococcus radiodurans)，如用紫外线照射致死90%，需要的光张强度为7000尔格/平方毫米;而对大肠杆菌(B.coli)来说，致死90%只需1尔格/平方毫米。两者相差7000倍。适宜诱变剂量一般选择在致死率90%～99.9%。但近年来为了得到有利于生产的正突变型菌株，往往采用致死70%～80%的低诱变剂量。致死率一般按下式计算:

诱变前总菌数-诱变后活菌数
致死率＝━━━━━━━━━━━━━×100%
诱变前总菌数

除上述以致死率表示诱变的相对剂量外，还可以用物理仪器测定绝对剂量，单位以尔格/平方毫米表示。但由于用仪器测定不便，所以一般不采用能量这一绝对剂量单位，而是用时间作为相对的剂量单位。生物体所受射线的剂量决定于灯的功率、灯和生物体的距离及照射的时间。灯的功率是固定的，灯的距离如果也是固定的话，那么，剂量就和照射的时间成正比关系，也就是说可以用照射的时间作为相对剂量。
紫外线的剂量可以通过延长照射时间或缩短距离而增加，短于灯管长度的1/3的距离内，强度和距离成反比关系;在这距离以外，则与距离的平方成反比关系。按照上述关系，适当的增加距离并延长照射时间，可以和缩短距离并减短时间得到相等的剂量。在射线的杀菌和诱变作用方面，只要总的剂量不变，一般并不因为处理时间的长短而效果不同。另外，只要总的时间相同，分次处理和一次处理的效果也基本相同。例如，连续处理10秒的杀菌和诱变作用，和照射两次、每次5秒的效果基本相同，只要两次处理的时间不是相隔太久。
诱变一般采用15W功率的紫外线灯，距离固定在3O厘米左右，采用这样的功率和距离时，使各种微生物细胞致死90%～99.9%所需的时间随微生物种类而不同。一般微生物营养体在紫外线下暴露3～5分钟即可死亡，芽孢或孢子在lO分钟左右也可死亡。革兰氏阳性菌和无芽孢菌比较容易杀死。用紫外线诱变抗菌素产生菌的气生孢子时，一般照30秒～2分钟，诱变枯草杆菌和短小芽孢杆菌的营养体以得到营养缺陷型时，照射时间一般为l～3分。紫外线杀菌能力虽然强，但穿透力比较弱，因此只有表面杀菌能力。
（五）诱变原生质体 原生质体由于没有细胞壁的遮蔽而对紫外线较敏感，但用双核菌丝制备的原生质体对紫外线的反应曲线有“平台现象”，在诱变试验时应予注意。据周伏忠等(1992)报道，金针菇双核菌丝制备的原生质体，对紫外线诱变有较强的抵抗能力。致死曲线比担孢子或单核菌丝制备的原生质体对紫外线的反应曲线下降坡度要小得多(用香菇所做)。在0～30秒，曲线下降到66%存活率水平，可见此期致死的原生质体是单核的(约占44%);在30～105秒，曲线下降甚缓，表现“平台现象”(图3-11) 可能是双核互补所致，其机理有待研究;105秒以后，曲线又迅速下降，可能此时双核损伤过重，导致原生质体不能再生。

图3-11 原生质体对紫外线的反应曲线
物理诱变因素除上述介绍的紫外线外，还有X射线、γ射线、快中子、α射线和超声波等，在育种研究中也经常应用，但所需设备较贵重，应用不太方便，因此不一一介绍。
    二、化学诱变
化学诱变因素能和辐射一样引起基因突变或染色体畸变。有关研究发现，从最简单的无机物到最复杂的有机物中都可以找到具有诱变作用的物质，但诱变效果显著的仅占其中极少数。
（一）化学诱变剂 根据化学诱变因素对DNA的作用机理，可将其分为三类:
第一类是与一个或多个核酸碱基发生化学变化，因而引起DNA复制时碱基配对的转换而引起变异。此类诱变剂如亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基弧、亚硝基甲基脲等。
第二类诱变剂可在DNA分子上减少或增加一二个碱基，从而引起碱基变化点以下全部遗传密码转录和翻译的错误。此类如吖啶类化合物。
第三类是天然碱基的类似物，它们可以掺到DNA分子中而引起变异，如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤和2-氨基嘌呤等。
上述第一类与第二类化学诱变剂可直接与DNA发生化学反应，然后通过细胞繁殖及DNA的复制而实现碱基对的转换。这类诱变剂作用于代谢活动十分缓慢的真菌孢子、细菌芽孢、游离的噬菌体，甚至离体的DNA;第三类则不能直接与DNA发生反应，必须通过活细胞的代谢才能掺入到DNA分子中发生诱变作用。
（二）亚硝酸诱变 亚硝酸(HNO2)的作用机制主要是脱去碱基上的氨基，如A,C,G分别脱去氨基而成为H(次黄嘌呤),U(尿嘧啶)、X(黄嘌呤)等，复制时它们分别与C，A，C配对。前面两种情况可以引起碱基对的转换(图3-12)而造成突变，而且，AT→GC，GC→AT的转换已经得到证实。由于X的分子结构只能与C配对，而不能与T配对，所以，它不能引起GC→AT的碱基对转换而造成突变。此外，亚硝酸还会引起DNA两链之间的交联而引起DNA结构上的缺失作用，目前对这方面的机制还不太清楚。

图3-12 碱基脱氨后DNA复制中的碱基对转换
亚硝酸不稳定，易分解为水和硝酸酐(2HNO2→N2O3＋H2O)，硝酸酐继续分解放出NO和NO2(N2O3→NO↑+NO2↑)，由此要采用在临用前将亚硝酸钠在pH4.5的醋酸缓冲液中生成亚硝酸的方法，反应为: NaNO2＋H+→HNO2＋Na+。
菌体经一定时间处理后，可用稀释来中止反应，或用氢氧化钠(NaOH)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)来中和剩余的亚硝酸（HNO2），也可将作用物吸入中性缓冲液中。诱变剂量可用处理时间来控制，存活率开始有一段较长延迟时间，以后与处理时间成直线关系。由于HNO2容易挥发，所以处理时须用密封小瓶进行。
（三）诱变实例 以蘑菇孢子为材料，具体方法如下:
配制lmol醋酸缓冲液:称取6.l2克冰醋酸，加蒸馏水到l00毫升；称取8.2克醋酸钠，加蒸馏水到l00毫升。将醋酸钠溶液徐徐加入到醋酸溶液中，到pH4.5为止(约为l:1)。
配制0.6mol亚硝酸（NaNO2）溶液:称取NaNO24.14克，加蒸馏水到l毫升。
配制0.7mol磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液(pH8.6):称取9.94克 Na2HPO4加蒸馏水到l00毫升。
以上三溶液使用前须灭菌。
取蘑菇孢子悬浮液2毫升(106/毫升)，加入1毫升0.1mol亚硝酸钠溶液和l毫升pH4.5缓冲液，27℃保温，这时亚硝酸钠的浓度为0.025mol。处理l0分钟(可根据需要定时间)后，取出2毫升加入到l0毫升0.07mol，pH8.6的磷酸氢二钠溶液中，这时pH下降到6.8左右，诱变作用中止(HNO2＋Na2HPO4→NaNO2＋NaH2PO4)。
将处理后的孢子悬液适当稀释，取0.2毫升涂完全培养基平皿，于28℃培养7～10天，长出菌落后根据需要筛选突变体。
三、突变体的筛选
诱变的目的是获得突变体。突变的类型包括形态变异、色素变化、酶活性的提高、抗药性及营养缺陷型等。营养缺陷型的筛选与应用简介如下:
所谓营养缺陷型，指经过诱变失去某些营养物质(如氨基酸、维生素、核酸碱基等)合成能力的变异菌株。这类变异株只有在基本培养基中补充了所需营养时才能生长。营养缺陷型菌株在工业上可用来生产氨基酸、核苷酸类物质；在生化研究中可用来了解氨基酸、核苷酸的生化合成途径;在遗传研究中可作为杂交、转化、转导或基因克隆的遗传标记菌株。鉴于营养缺陷型变异菌株如此有用，故对筛选及鉴定方法作较为详细的介绍：
（一）营养缺陷菌株浓缩 在诱变后的孢子或原生质体群体中，营养缺陷型发生的频率一般在百万分之几，有的甚至更低。因此，需改变群体中原养型与营养缺陷型两者的比例，使后者相对增加而便于检出，此过程叫做浓缩。
丝状真菌养缺陷型的浓缩可用菌丝过滤法，原理是在基本培养液中，原养型的孢子会萌发长出菌丝来，而缺陷型则不会萌发。将培养一段时间的培养物过滤，可以淘汰大部分原养型菌丝而起到浓缩作用。例如，将紫外线诱变过的孢子悬浮培养在基本培养液中，振荡培养l8小时后用灭菌脱脂棉过滤，滤液涂完全培养基培养，生出的菌落中有较高比例的营养缺陷型。
（二）营养缺陷型的检出 对担子菌的菌丝而言，可采用逐个检出法将营养缺陷型与原养型分开。这种方法是将诱变后的菌株逐一编号，每株菌同时转接基本培养基(mm)和完全培养基(Cm)，于28℃培养7～lO天 。凡在Cm上生长而在mm上不长者，初步判断为营养缺陷型。为保证检出效果，应注意以下两个问题:
一是琼脂的纯化。制备基本培养基用的琼脂必须纯净。琼脂成分主要是多糖，含少量钙、镁、钠、钾等矿物质和生长素。纯化的方法是将市售琼脂用45℃以下温水浸洗2次，可去掉水溶性杂质、无机盐、生长素和色素等，然后用流动自来水冲洗2～3天，至颜色变白为止，拧干，用95%乙醇浸泡过夜。次日取出拧干乙醇，将琼脂裹于纱布中晾干备用。
二是防止菌落蔓延。为防止菌丝蔓延影响检出和鉴定，需在培养基中加入去氧胆酸钠抑制菌落的生长。
（三）营养缺陷型的鉴定 营养缺陷型可能需要氨基酸，也可能需要核酸碱基或维生素，到底缺哪一种尚需要进行鉴定。例如，可将多种氨基酸组合排列，纵横分为9组(表4-6)，然后把它们分别加到基本培养基中，1～5组每组含 4种氨基酸；6～9组每组含5种氨基酸，每种氨基酸同时存在于两组中。如某菌株仅在2组、8组培养基上生长，经查表知其为赖氨酸缺陷型。如增加核苷酸与维生素缺陷型的筛选，将这些物质组合到表3～4中即可。
另一种鉴定方法是在配制基本培养基时，将20种氨基酸分别依次缺少一种而使其中含其他19种氨基酸，而后接上待测菌株， 经培养在哪种培养基上不长即需要末加的该种氨基酸。这种方法的好处是可以一次同时将需要两种以上氨基酸的菌株鉴定出来。
表3-4 氨基酸组合及用量
组 合 第一组 第二组 第三组 第四组 第五组
第六组(mg/L) 丙氨酸 40 精氨酸 20 天冬酰胺70 天冬氨酸 70 半胱氨酸 120
第七组(mg/L) 谷氨酸 90 谷酰胺 90 甘氨酸 40 组氨酸 80 异亮氨酸 70
第八组(mg/L) 亮氨酸 70 赖氨酸 70 蛋氨酸 70 苯丙氨酸80 脯氨酸60
第九组(mg/L) 丝氨酸 50 苏氨酸 60 色氨酸 100 酪氨酸 90 缬氨酸 60
四、基因工程育种
基因工程是分子水平上的遗传工程。主要包括目的基因的标记与分离，目的基因与载体连接构建新的重组DNA，然后通过原生质体融合、转化、转导或DNA分子杂交技术等转移到受体细胞中进行正常复制和表达，从而产生遗传物质和性状的转移和重新组合，获得人们所期望的新种。
当前，应用基因工程改良蘑菇品种的主要目标有三个:第一是提高对栽培基质的降解转化能力，提高单产;第二是改良蘑菇的抗病虫性基因，提高栽培品种的抗病虫害能力;第三是改良褐变基因，提高鲜菇保鲜能力。
基因工程育种的基本技术如下：
（一）目的基因分离 分离基因的方法有理化方法或噬菌体摄取法，取得供体细胞内的“目的”基因，或用化学、酶促方法人工合成"目的"基因。
（二）目的基因体外重组 这个过程需有两种酶的参与，一种为限制性内切酶，是一种水解DNA的磷酸二酯酶，目前主要用分子量小于l0万的限制酶，在mg2+存在下专一性强。另一种为连接酶，用于修复双链DNA分子上的缺口或裂口，是通过合成邻近核苷酸之间的磷酸二酯酶链修复"缺口"或单链DNA的裂重组过程是用特异的限制性内切酶切割供体及载体的DNA，所得的DNA片段通过粘接末端对应碱基间的氢键组合到一起，再经DNA连接酶的作用，将切口接合起来，成为一个完整的重组的DNA分子。
（三）载体 载体即运载基因的工具。体外重组的DNA分子通过基因载体进入受体细胞，才能进行复制和表达。载体传递可以通过细菌质粒进行，也可以通过某些噬菌体、病毒或线粒体DNA进行。在大肥菇线粒体中发现有类质粒DNA(pl-DNA)，但在蘑菇中尚未发现，目前有人探讨利用蘑菇线粒体DNA作为载体。
（四）转化 有些蘑菇育种者利用基因枪或原生质体电融合等技术把目的基因片段不植入载体而直接转入受体细胞中进行外源基因表达。
（五）复制表达 基因工程的最后一个关键在于“目的”基因(重组DNA或外源DNA)在受体细胞中能复制而扩增，表达出新的遗传性状。
（六）新菌株筛选 重组基因所表达出的新性状是否符合要求需要做大量的筛选工作，从大量个体中筛得具有理想性状的个体，才能加以繁殖和利用。
（七）蘑菇的遗传标记位点
1．交配性因子与子实体产生的相关位点 在改良蘑菇菌株的特性之前，先了解其生殖体系及其遗传基础是十分必要的。
蘑菇的性特征是属于无锁状联合的次级同宗配合，担孢子通常是自体可育的;蘑菇的性因子属于二极性，由一对性因子A1A2控制。进一步的研究表明，蘑菇的性因子可能存在A3A4等复等位基因(Raper等，1972;Elliott l979;Wang等，1990)。性因子决定细胞壁的亲和性但并不保证子实体的发育(Esser,l979;May等，1982;Wang，l990)。1990年加拿大多伦多大学生物系Anderson教授实验室开展了染色体与DNA水平的探讨，Xu等人以RFLP和RAPD标识辅助成功地把配合型性因子基本上定位在第I条染色体上，并进一步作配合型性因子与子实体发动基因的定位，计划把这些基因克隆出来做分子遗传研究，并得出结论:子实体的形成有赖于性因子，但由性可亲和的同核菌丝配合形成的异核体并不绝对地保证子实体的形成(Xu等，1993)。此外，Harmsen等(1991),Wassels(1991)还分别对蘑菇2个连锁的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因与发育中的疏水基因进行了分离与研究。国内在DNA水平上的研究刚刚起步。在其他食用菌方面，Meinhardt等人(1981)报道了杨树菇(Agrocybe aegerita)与子实体发动、发育有关的基因Su,fi和fb的研究结果。Raper等(l991)报道了一个诱导裂褶菌子实体发育的DNA序列。Shishido(1992)报道了与香菇结实性相关的基因结构与功能。总之，在基因水平上的研究仍属探索，但可望在不久的将来有较大的突破。
2．与基质降解相关的标记位点 一个菌株降解基质的能力直接影响到其产、质量性状的表现。蘑菇降解基质的重要酶类，木质素酶(漆酶等)、纤维素酶位点始终是蘑菇育种家与生理生化学家研究的重点。先前，已有人应用遗传型差异与降解基质能力的大小评价菌株的优劣(Kulkarm等，1989)。英国温室作物研究所克隆了蘑菇的产漆酶基因，并试图把抗病虫害基因，降解基质的纤维素酶基因，与保鲜相关的基因，分离鉴定出来并用于转化育种(Elliott,1988)。
3．与产、质量相关的标记位点 寻找能预测新菌株产、质量性状的标记位点，无疑是蘑菇育种家的重大课题，它不仅能使育种家从成千上万个新菌株中快速识别出可能的优良菌株，提高育种效率，并能为目的基因的确定与克隆奠定基础，除了降解基质的木质素酶、纤维素酶位点与菌株产、质量性状相关外，还有一些重要的酶类，比如蘑菇的酯酶、乙醇脱氢酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、细胞色素氧化酶同工酶与水可溶性蛋白，这6个生化标记已被证明与不同类型菌株的产、质量性状明显相关(Wang等，1989)。
4．与蘑菇褐变相关的标记位点 几乎所有的食用菌子实体都是生长快速而又容易腐败的，蘑菇也不例外。因而，蘑菇栽培者与加工厂商都希望育种家为他们提供不易褐变、风味好、保鲜能力强的优良品种。1988年，美国Monterery研究室的Wach等将荷兰育种家Fritsche育成的杂交种Ul的DNA片段导入大肠杆菌，建立起基因文库，并尝试把某些DNA片段导入其他菌株，以期育成不易发生褐变的优良菌株。199l年，Khush等应用PCR技术扩增重要的DNA片段，对能催化褐变的蘑菇酪氨酸酶的基因作了研究。
（八）基因文库的建立 食用菌基因工程研究的另一内容是通过提取菌株的高分子量总DNA，经酶切和电泳或密度梯度离心，获得一定长度(Kb)的总DNA酶切片段，以细菌质粒等为载体，经过酶连形成重组DNA，再转入受体菌中构建为基因组文库。进一步应用分子杂交技术，从文库中筛选特异性基因(目的基因)，再应用于食用菌遗传育种等研究之中。80年代始，国内外开展了这方面的工作。如Esser等于1983年提出利用线粒体DNA或者类质粒作为真核细胞的载体。Elliott和Noel等(1987)建立了蘑菇和杨树菇的基因文库。Challen等(l991)提出了蘑菇转化的策略。Koyer等(199l)展望了蘑菇转化系统的现状与未来。吕作舟等(1992,1993)报道了平菇基因组文库的构建。笔者（1998）利用能够转化细菌和真菌的双功能质粒pDL1，将pDL1与糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的DNA片段连接，然后转化玉米黑粉菌(Ustilago maydis)的原生质体，建立了糙皮侧耳的基因文库，在玉米黑粉菌细胞中克隆糙皮侧耳纤维二糖水解酶基因成功。此外，裂褶菌与鬼伞类的基因组文库也被构建起来。
对蘑菇遗传生活史及其基因基础的认识，从个体水平、细胞水平、提高到分子水平，使我们能够把它们与配合型性因子，控制子实体发动、发育，控制降解基质能力，与产、质量性状相关或影响子实体褐变，风味的重要标记位点作为目的基因来进行研究。上述四个方面，只要任一方面获得突破性进展部将把蘑菇的育种技术真正提高到分子水平，对改良菌株特性，提高生产的经济效益都将产生重大的影响。
（九）染色体组型及遗传连锁图 脉冲电泳的发明使得分离染色体、分析核型成为可能。Royse(l991)，Sonnenberg(1991)及Lodder(1993)先后将这项技术应用于蘑菇的研究，并且进展很快。应用Novozyme234酶制备原生质体的得率可高达1.6～6.7×l09/克菌体，满足进行脉冲电泳的制样需求。在各项参数被优化后的电泳条件下，蘑菇的核型在电泳胶上表现为11个条带，分子量分布在l.1到5.7，基因组总长约34mb，进一步进行Sorthern杂交则确证蘑菇染色体一共有13条。早在1959年Evans也曾通过染色镜观察，估计染色体有9条。蘑菇的染色体组型，在各菌株间呈明显多态，并且遗传物质在杂交子中是非等量混合的。Kerrigan还发现同核株的菌丝活力往往与一定染色体片段相关联。应用脉冲电泳分离蘑菇的染色体，配合分析各标记在亲本及其子代中的分离情况，Kerrigan 于l993年建立了包括同工酶、RAPD、rDNA重复序列以及少量外部表型性状等多种标记的遗传连锁图。混合标记连锁图的建立为今后迸一步分析蘑菇的遗传行为，定位克隆有关基因提供了一个很好的参照标尺。
脉冲电泳在蘑菇遗传研究中的最新发展是1996年Sonnerberg将从cDNA文库中分离得到的表达序列标记忆(ETS)定位于蘑菇相应的染色体上，其中包括ATP合成酶、漆酶、纤维素酶等已被克隆测序的与蘑菇菌丝的生理生化特性相关基因。Sonnerberg的研究取材为Ul菌株的两个同核双亲。研究发现rDNA在染色体中拷贝数的不同可导致相同的染色体的长度在不同菌株中发生变化。这是染色体组型在菌株中呈现多态性的原因之一。表达序列标记及某些功能基因的定位有利于今后对这些基因的表达、调控作深入的研究。
（十）mtDNA的遗传 线粒体DNA(mtDNA)是真菌中最主要的染色体外遗传物质，遗传方式独特。该遗传系统虽受控于核系统，但仍存在特殊的DNA复制机制，RNA拼接机制以及个别有别于“通用”密码子的遗传密码子。
对蘑菇mtDNA的研究始于1988年，此年Hintz构建了蘑菇的mtDNA的物理图谱。发现蘑菇的大小为136Kb，是在真菌中发现的分子量较大的mtDNA。从得到的酶谱来看，线粒体基因组也同其他的真核生物(尤其真菌)一样大致可分为可变区与保守区，但米tDNA的编码能力稳定，在种间及种内显现多态性的原因主要在于基因组内含子数量的变化。另外，所有mtDNA中均存在反向重复序列，此类序列有时双向存在，暗示蘑菇mtDNA中存在转座行为，从而导致分子内重组(Sonnerberg，1991)。
尽管蘑菇mtDNA在种内存在多态性，但由于蘑菇保守的遗传机制以及长期以来在栽培中标准单一的人工筛选，其多态性明显不如其他物种显著。Sonnerberg等用限制性酶切产生多态酶谱的方法发现三种mtDNA，即使后来Jin(l992)再用RFLP标记探针杂交，也仅能区分出四种mtDNA，这是蘑菇种质危机的另一体现。
mtDNA的遗传是单亲遗传，不同线粒体DNA的同核株的杂交子只承袭其中一个亲本的基因型，而且往往是生长得较快亲本的线粒体基因型。但如果让生长较慢的同核株先生长一段时间后，再与生长较快的同核亲本杂交，则在菌丝的融合区可分离到包含两亲本线粒体基因型的异核子代，在子代中两亲本的胞质分配不均是造成mtDNA单亲遗传的原因之一(Jin,l994)。杂交子中极少发现有重组型线粒体DNA，但重组型线粒体DNA可在原生质体融合株中发现，因为电融合导致线粒体融合。所以从育种角度来看，原生质体融合比单孢杂交更易产生新种。

作者：贾乾义