一、食药用菌遗传学基础
㈠ 遗传与变异 何谓遗传?“种瓜得瓜，种豆得豆”,“龙生龙，凤生凤”，物种代代相似的现象即为遗传。何为变异?“一母生九子，九子各有别”，这种子代与亲代之间以及子代相互之间的不同即为变异。遗传和变异是对立统一的一对矛盾，它们相辅相成，缺一不可，遗传是生物生存和繁衍的基础，它使物种相对稳定;变异是生物进化的动力，它造就了生物大千世界。遗传是相对的，变异则是绝对的，没有变异就不能研究遗传。和其他生物一样，食药用菌的遗传与变异亦符合对立统一规律。从统一角度来看，食药用菌的遗传性是很稳定的，它的种性时不会因一般环境条件的变化而发生变异。例如营养、水分、湿度、温度、酸碱度、光线和二氧化碳等环境因子的变化一般只会影响食药用菌菇子实体的形状、大小、色泽和产量，而不容易导致食药用菌种性的改变，即不能造成可遗传的变异。可遗传的变异只有两类，即遗传基因的重组和基因突变所导致的变异。如平菇的产孢缺陷型就是可以遗传的变异。无孢平菇的子实层不能产生担孢子，只能通过菌丝体的转接即无性繁殖来保持其不产孢子的变异性状。在生产上应用的还有白色金针菇、白色木耳、白色灰树花等新品种，都是遗传性状很稳定的变异菌株。
㈡ 遗传变异的物质基础 遗传变异的物质基础是什么?这个问题需要从分子水平和细胞水平两个层次来阐述。
1.遗传物质的分子结构 1944年Avery等从肺炎双球菌的转化试验中发现，决定生物性状的转化因子是DNA(脱氧核糖核酸)而不是蛋白质，证明DNA是遗传物质。1953年，Watson和Crick又确定了DNA分子结构是双股螺旋，由此阐明遗传的机制就是DNA分子的半保留复制，从而开创了分子遗传学这一划时代的学科领域。
DNA分子由脱氧核糖核酸组成;脱氧核糖核酸由脱氧核糖、
磷酸和4种碱基组成。这些碱基是:胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(A)。在DNA两条单键的相对位置上，碱基有互补配对关系(图3-1)，即A与T和C与G，碱基的这种对应关系被称为“互补法则”。

图3-1 DNA分子的平面结构
磷酸(P)和脱氧核糖(D)在DNA链的外侧，碱基(A:T、C：G)
在链的内侧互补配对，两条链通过碱基的氢键相连接

2.基因控制性状的过程 基因是遗传物质的最小功能单位。从分子水平而言，基因是DNA分子中负载遗传信息的特定核苷酸序列。基因包括结构基因和调控基因等多种形式。DNA链中的遗传信息如何控制生物的某种表型性状呢?主要是通过DNA的复制、转录和翻译而使基因得以表达来控制的。不同的食药用菌之所以有不同的形态特征和生理代谢，就在于它们的遗传基因各不相同。
基因决定蛋白质的结构和功能。基因的化学成分是4种脱氧核苷酸，蛋白质的化学成分是20种氨基酸。脱氧核苷酸单链中每3个碱基为一组遗传密码，可形成433=64组密码，对应于20种氨基酸绰绰有余。
DNA主要存在于细胞核内，蛋白质却是在细胞质内的核糖体上合成，所以，需要RNA(核糖核酸)作为信使把核内DNA的遗传信息转录到核外，在核糖体rRNA和转运tRNA的帮助下，由不同的三联体密码转译为各种氨基酸。氨基酸序列的不同决定了蛋白质的复杂性，进而也就有了生物性状的多样化。DNA的复制、转录和转译等生物化学过程如图3-2所示。

图3-2 DNA的复制、转录和转译
遗传信息的传递(从基因到蛋白质)经历两个阶段:第一阶
段,按照DNA转录链的遗传密码顺序合成讨mRNA；第二阶
段，转译。tRNA把氨基酸运载到核糖体上，核糖体(从左
到右)沿着mRNA移动，氨基酸顺序由mRNA的密码顺序决
定，氨基酸之间由肽链连接

二、食药用菌诱变育种
同“种”的标准是相互交配可育。交配不育或交配不能产生可育后代的不同个体为异种。例如，马和驴杂交产生的骡不育，则马和驴为异种。平菇“菌种”的定义也是如此。优良菌种通常具有高产、优质、抗逆等特性，因而在不增加生产成本的条件下，采用优种的经济效益较一般品种为高。因此，在食药用菌的栽培生产中，优良菌种的选育是重要的基础工作。习惯上，从自然界中选择已有菌株供生产上应用的方法称为选种或驯化，而通过基因诱变、杂交或其他生物技术如转基因、细胞融合、基因工程等手段改变个体的基因型，创造新品种的过程称作育种。
德国真菌学家Esser曾提出“协调育种”的技术路线。其主要内容有三个:第一要有基因突变;第二是基因重组;第三是综合筛选。突变和重组可以使物种产生变异，综合筛选才能获得高产、优质、适应性强的目的菌株。
育种原理和应用技术较为复杂亦很重要，对此方面的内容从实用角度进行介绍。
突变可分为自发突变和诱发突变，前者指生物体自然发生的遗传变异，特点是发生频率很低，真菌一般为lx10-6-8;后者是人工采用物理、化学方法处理生物体而诱发的遗传变异，优点是可显著提高突变频率，加快育种速度。
㈠物理诱变
1．紫外线 在育种实践中应用最方便最广泛的物理诱变因素是紫外线。这种光线的波长稍短于可见光中的紫光，波长范围从136-390nm。它是一种非电离辐射，能使被照射物质分子或原子中内层电子提高能级，但并不获得或失去电子，所以不产生电离。
紫外线诱变的最佳波长范围是200-300nm，其中又以260nm左右最佳。之所以能引起杀菌或诱变，主要是由于遗传物质DNA吸收紫外线而受影响。一般15W低功率紫外灯放出的光谱较集中于260nm，适用于进行诱变。如果用30W以上的高功率紫外灯，则放出的光谱较平均分散，所以，诱变效果反而不如低瓦灯好。
2．诱变原理 紫外线的生物学效应主要在于它可引起DNA的变化。DNA强烈吸收紫外线，尤其是DNA链上的碱基对。对紫外线嘧啶比嘌呤敏感得多，几乎要敏感100倍。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链断裂、DNA分子内和分子间的交联、核酸与蛋自质的交联，胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及嘧啶二聚体的形成。特别是后者，实验证明，受紫外线照射的胸腺嘧啶溶液改变了原来对紫外线吸收的特征，实际上已形成了另一种产物，经元素分析、分子量测定、结晶形态分析和红外光谱分析，证明是胸腺嘧啶的二聚体。它的变化过程是两个胸腺嘧啶的双键先分别变为单键，在变成单键的碳原子之间的新键处相互连接，并在两个嘧啶环上相应的C5和C6原子间的C键处，形成处于两个胸腺嘧啶间的环状键(图3-3)。

图3-3 胸腺嘧啶二聚体的形成
胸腺嘧啶二聚体的形成有重要的生物学意义。前面已经谈过，当DNA复制时，双链须先变成单链，然后各自再与附近的碱基形成互补链，两链之间嘧啶二聚体的交联会阻碍双链的分开和复制。同侧链上相邻胸腺嘧啶二聚体的形成，会阻碍碱基的正常配对。在正常情况下，胸腺嘧啶应与腺嘌呤配对，但两个相邻胸腺嘧啶的连接就可能改变这种情况，足以破坏腺嘌呤的正常掺入。复制会在这一点上突然停止或错误的进行。如新生成的DNA单链改变了的碱基顺序，则在随后的复制过成中，已改变的DNA链仍以自身为模板进行复制，进而产生了一个在两条链上碱基顺序都有错误的分子，其后果是基因突变。
紫外线除造成DNA两条单链之间胸腺嘧啶二聚体的形成外，还导致DNA一条单链上相邻胸腺嘧啶的交联、胞嘧啶水合、氢键断裂、DNA链断裂等变化。
3．光复活作用 光复活在自然界是一个比较普遍的现象，是生物细胞对紫外线损伤的一种修复功能。经紫外线照射后，食药用菌细胞有两种类型的光复活:一种是直接光复活，即经过可见光照射后大部分DNA损伤可以恢复，甚至看来己显示死亡的细胞也复活了。这种光复活作用是通过光激活酶而发生的，这种酶可以使胸腺嘧啶二聚体解开而重新成为单体，一种特异的酶制剂在蓝光下，可以打断DNA中的胸腺嘧啶二聚体达90%。
另一种复活称作间接光复活，也称为黑暗复活。其原因是细胞在黑暗中减慢了大分子合成过程，这样便有利于某些生物体产生恢复DNA损伤的酶，而这种酶的产生是不需要可见光的。该过程包括特殊的核酸酶把含有胸腺嘧啶二聚体的DNA双链变成单链、切断二聚体、修复、复制而形成新的DNA双螺旋。
光复活能力的强弱，不同的菌甚至同一种菌的不同品系都有差异。对于那些有光复活能力的菌，照射以后必须避免把孢子悬液放在长波紫外光和短波的可见光中。在实践中也可使用此原
理，利用致死剂量的紫外光与日光(300W-500W)反复交替
处理，以增加被处理菌的变异幅度。导致光复活的光谱范围各种菌也是不一样的，如大肠杆菌为375nm，灰色链霉菌为435nm。一般波长大于525nm影响就不大。所以，照射后的操作可以在黄光下进行(黄光波长535-585nm，橙光586-654nm，红光646-760nm)。
4．诱变的剂量 各种菌类对紫外线的敏感程度差异很大，可以相差成千上万倍。例如，有一种抗辐射的小球菌(Micrococcus radiodurans)，如用紫外线照射致死90%，需要的光张强度为7000erg/mm2;而对大肠杆菌(B.coli)来说，致死90%只需1erg/mm2。两者相差7000倍。适宜诱变剂量一般选择在致死率90%-99.9%。但近年来为了得到有利于生产的正突变型菌株，往往采用致死70%-80%的低诱变剂量。致死率一般按下式计算:

诱变前总菌数-诱变后活菌数
致死率＝━━━━━━━━━━━━━×100%
诱变前总菌数

除上述以致死率表示诱变的相对剂量外，还可以用物理仪器测定绝对剂量，单位以erg/mm2表示。但由于用仪器测定不便，所以一般不采用能量这一绝对剂量单位，而是用时间作为相对的剂量单位。生物体所受射线的剂量决定于灯的功率、灯和生物体的距离及照射的时间。灯的功率是固定的，灯的距离如果也是固定的话，那么，剂量就和照射的时间成正比关系，也就是说可以用照射的时间作为相对剂量。
紫外线的剂量可以通过延长照射时间或缩短距离而增加，短于灯管长度的1/3的距离内，强度和距离成反比关系;在这距离以外，则与距离的平方成反比关系。按照上述关系，适当的增加距离并延长照射时间，可以和缩短距离并减短时间得到相等的剂量。在射线的杀菌和诱变作用方面，只要总的剂量不变，一般并不因为处理时间的长短而效果不同。另外，只要总的时间相同，分次处理和一次处理的效果也基本相同。例如，连续处理10秒的杀菌和诱变作用，和照射两次、每次5秒的效果基本相同，只要两次处理的时间不是相隔太久。
诱变一般采用15W功率的紫外线灯，距离固定在3Ocm左右，采用这样的功率和距离时，使各种微生物细胞致死90%-99.9%所需的时间随微生物种类而不同。一般微生物营养体在紫外线下暴露3-5分钟即可死亡，芽孢或孢子在lO分钟左右也可死亡。革兰氏阳性菌和无芽孢菌比较容易杀死。用紫外线诱变抗菌素产生菌的气生孢子时，一般照30秒 -2分钟，诱变枯草杆菌和短小芽孢杆菌的营养体以得到营养缺陷型时，照射时间一般为l-3分。紫外线杀菌能力虽然强，但穿透力比较弱，因此，只有表面杀菌能力。
5．诱变原生质体 原生质体由于没有细胞壁的遮蔽而对紫外线较敏感，但用双核菌丝制备的原生质体对紫外线的反应曲线有“平台现象”，在诱变试验时应予注意。据周伏忠等(1992)报道，金针菇双核菌丝制备的原生质体，对紫外线诱变有较强的抵抗能力。致死曲线比担孢子或单核菌丝制备的原生质体对紫外线的反应曲线下降坡度要小得多(用香菇所做)。在0-30秒，曲线下降到66%存活率水平，可见此期致死的原生质体是单核的(约占44%);在30-105秒，曲线下降甚缓，表现“平台现象”(图3-4) 可能是双核互补所致，其机理有待研究;105秒以后，曲线又迅速下降，可能此时双核损伤过重，不足于指导原生质体细胞壁再生及生长。

图3-4 原生质体对紫外线的反应曲线
6．诱变育种成功实例 笔者所在的研究组曾利用紫外线诱变获得了平菇的无孢子突变株（1987）;黑木耳的天门冬氨酸
(asp-)缺陷型与毛木耳的腺嘌呤、脯氨酸、尼克酸(ade-,pro-，nic-)三缺陷型;草菇的腺漂岭(ade-)缺陷型。用这些遗传标记菌株做亲本，采用杂交和原生质体融合技术，分别育成了无孢平菇(1987)和杂交木耳(1990)等有商品价值的菌株。
物理诱变因素除上述介绍的紫外线外，还有X射线、γ射线、快中子、α射线和超声波等，在育种研究中也经常应用，但所需设备较贵重，应用不太方便，因此不一一介绍。
㈡ 化学诱变 化学诱变因素能和辐射一样引起基因突变或
染色体畸变。有关研究发现，从最简单的无机物到最复杂的有机物中都可以找到具有诱变作用的物质，但诱变效果显著的仅占其中极少数。
1．化学诱变剂种类 根据化学诱变因素对DNA的作用机理，可将其分为三类:
第一类是与一个或多个核酸碱基发生化学变化，因而引起DNA复制时碱基配对的转换而引起变异。此类诱变剂如亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、硝基弧、亚硝基甲基脲等。
第二类诱变剂可在DNA分子上减少或增加一二个碱基，从而引起碱基变化点以下全部遗传密码转录和翻译的错误。此类如吖啶类化合物。
第三类是天然碱基的类似物，它们可以掺到DNA分子中而引起变异，如5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤和2-氨基嘌呤等。
上述第一类与第二类化学诱变剂可直接与DNA发生化学反应，然后通过细胞繁殖及DNA的复制而实现碱基对的转换。这类诱变剂作用于代谢活动十分缓慢的真菌孢子、细菌芽孢、游离的噬菌体，甚至离体的DNA;第三类则不能直接与DNA发生反应，必须通过活细胞的代谢才能掺入到DNA分子中发生诱变作用。
2．亚硝酸诱变机理 亚硝酸(HNO2)的作用机制主要是脱去碱基上的氨基，如A,C,G分别脱去氨基而成为H(次黄嘌呤),U(尿嘧啶)、X(黄嘌呤)等，复制时它们分别与C,A,C配对。前面两种情况可以引起碱基对的转换(图3-5)而造成突变，而且，AT→GC，GC→AT的转换已经得到证实。由于X的分子结构只能与C配对，而不能与T配对，所以，它不能引起GC→AT的碱基对转换而造成突变。此外，亚硝酸还会引起DNA两链之间的交联而引起DNA结构上的缺失作用，目前对这方面的机制还不太清楚。

图3-5 碱基脱氨后DNA复制中的碱基对转换
亚硝酸很不稳定，易分解为水和硝酸酐(2HNO2→N2O3＋H2O)，硝酸酐继续分解放出NO和NO2(N2O3→NO↑+NO2↑)，由此要采用在临用前将亚硝酸钠在pH4.5的醋酸缓冲液中生成亚硝酸的方法，反应为: NaNO2＋H+→HNO2＋Na+。
菌体经一定时间处理后，可用稀释来中止反应，或用地NaOH、NaHPO4来中和剩余的HNO2，也可将作用物吸入中性缓冲液中。诱变剂量可用处理时间来控制，存活率开始有一段较长延迟时间，以后与处理时间成直线关系。由于HNO2容易挥发，所以处理时须用密封小瓶进行。
3．亚硝酸诱变实例 以平菇孢子为材料， 具体方法如下:
①配制lM醋酸缓冲液。称取6.l2g冰醋酸，加蒸馏水到l00ml；称取8.2g醋酸钠，加蒸馏水到l00ml。将醋酸钠溶液徐徐加入到醋酸溶液中，到pH4.5为止(约为l:1)。
②配制0.6M NaNO2溶液。称取NaNO24.14g，加蒸馏水到lml。
③配制0.7M Na2HPO4溶液(pH8.6)。称取9.94g Na2HPO4加蒸馏水到l00ml。
以上三溶液使用前须灭菌。
④取平菇孢子悬浮液2ml(106/ml)，加入1ml0.1M亚硝酸钠溶液和lmlpH4.5缓冲液，27℃保温，这时亚硝酸钠的浓度为0.025M。
⑤处理l0分钟(可根据需要定时间)后，取出2ml加入到l0ml0.07M，pH8.6的磷酸氢二钠溶液中，这时pH下降到6.8左右，诱变作用中止(HNO2＋Na2HPO4→NaNO2＋NaH2PO4)。
⑥将处理后的孢子悬液适当稀释，取0.2ml涂完全培养基平皿，于28℃培养7-10天，长出菌落后根据需要筛选突变体。
除亚硝酸外，硫酸二乙酯的诱变效果也很显著。例如，周伏忠(1992)用硫酸二乙酯诱变佛州侧耳的担孢子后，对l200株单核菌株进行鉴定，从中筛选出25株营养缺陷型突变体，平均突变率为2.05%。此外，还获得了15株生长缓慢的形态突变体。
㈢.突变体的筛选 诱变的目的是获得突变体。突变的类型包括形态变异、色素变化、酶活性的提高、抗药性及营养缺陷型等，它们的筛选与应用简介如下:
1．形态与色素变异 在突变体中，形态与色素方面的变异是显而易见的。对食药用菌来说，形态与色素变异可分为两个层次:一是菌落;二是子实体。例如美味侧耳(Pleurotus sapidus)
的担孢子经紫外线诱变后，有部分存活孢子萌发出了特异型菌落，有的呈皱折式生长，有的气生菌丝消失，有的分泌色素，有的菌丝生长速率加快，经反复转接这些性状亦不消失。从中选出生长旺盛并确认为是单核体的菌株与野生糙皮侧耳(P.ostreatus)的单核菌株杂交，从异核体中筛选出了少孢和无孢平菇。
需要指出，不产孢子的突变基因也存在于未经诱变的菌株中，尤美莲、张树庭(1989)对无孢佛州侧耳(P.florida)的研究证明，无孢子实体性状由一对隐性基因所控制，其符合一对非连锁隐性基因的分离比例(详见本节杂交与重组)。
许多具有商品生产价值的变种如白色金针菇、白色木耳、白色灰树花、浅色草菇及香菇等，均属于色素变异类型。它们之中有的是经过物理化学因素诱变、杂交等手段而获得的诱变株，有的是偶然发现的自然突变株。
自然突变的机率只有百万分之一，只有具备丰富育种知识的人才
能抓住这种机遇。否则，当与众不同的变异株出现于的
眼前时，很可能遭到被淘汰的命运!
2. 酶活性变异 诱变后酶活性方面的变异不能凭直观筛选，但可采用间接测定法初筛，例如，将碘加入培养基中来指示液化淀粉酶活力的高低;在加有纤维素的培养基上，透明圈的大小可说明纤维素酶活力的强弱等。
3. 抗药性变异 被诱变菌株对其敏感的某种毒性化合物产生了抗性即为抗药性变异。与选择营养缺陷型变异株相比， 筛选抗药性菌株有两个优点:一是易于筛选，因为诱变后的大量孢子或原生质体可直接在含有毒物的培养基上进行筛选，只有具抗性的变异株才能生长。如贺建超等(1992)诱变筛选出抗多菌灵的美味侧耳和抗丙硫咪唑的糙皮侧耳。二是有利于生产，抗杀菌剂的品种便于使用杀菌剂控制杂菌浸染。

4. 营养缺陷型 经过诱变失去某些营养物质(如氨基酸、 维生素、核酸碱基等)合成能力的变异菌株为营养缺陷型。这类变异株只有在基本培养基中补充了所需营养时才能生长。营养缺陷型菌株在工业上可用来生产氨基酸、核苷酸类物质；在生化研究中可用来了解氨基酸、核苷酸的生化合成途径;在遗传研究中可作为杂交、转化、转导或基因克隆的遗传标记菌株。鉴于营养缺陷型变异菌株如此有用，这里对其筛选及鉴定方法作较为详细的介绍。
⑴ 营养缺陷菌株浓缩 在诱变后的孢子或原生质体群体中，营养缺陷型发生的频率一般在百万分之几，有的甚至更低。因此，需改变群体中原养型与营养缺陷型两者的比例，使后者相对增加而便于检出，此过程叫做浓缩。
丝状真菌养缺陷型的浓缩可用菌丝过滤法，原理是在基本培养液中，原养型的孢子会萌发长出菌丝来，而缺陷型则不会萌发。将培养一段时间的培养物过滤，可以淘汰大部分原养型菌丝而起到浓缩作用。例如，将紫外线诱变过的孢子悬浮培养在基本培养液中，振荡培养l8小时后用灭菌脱脂棉过滤，滤液涂完全培养基培养，生出的菌落中有较高比例的营养缺陷型。
⑵ 营养缺陷型的检出 对担子菌的菌丝而言，可采用逐个检出法将营养缺陷型与原养型分开。这种方法是将诱变后的菌株逐一编号，每株菌同时转接基本培养基(MM)和完全培养基(CM)，于28℃培养7-lO天 。凡在CM上生长而在MM上不长者，初步判断为营养缺陷型。为保证检出效果，应注意以下两个问题:
一是琼脂的纯化。制备基本培养基用的琼脂必须纯净。琼脂成分主要是多糖，含少量钙、镁、钠、钾等矿物质和生长素。纯化的方法是将市售琼脂用45℃以下温水浸洗2次，可去掉水溶性杂质、无机盐、生长素和色素等，然后用流动自来水冲洗2-3天，至颜色变白为止，拧干，用95%乙醇浸泡过夜。次日取出拧干乙醇，将琼脂裹于纱布中晾干备用。
二是防止菌落蔓延。为防止菌丝蔓延影响检出和鉴定，需在培养基中加入去氧胆酸钠抑制菌落的生长。
⑶ 营养缺陷型的鉴定 营养缺陷型可能需要氨基酸，也可能需要核酸碱基或维生素，到底缺哪一种尚需要进行鉴定。例如，可将多种氨基酸组合排列，纵横分为9组(表3-1)，然后把它们分别加到基本培养基中，1-5组每组含 4种氨基酸；6-9组每组含5种氨基酸，每种氨基酸同时存在于两组中。如某菌株仅在2组、8组培养基上生长，经查表知其为赖氨酸缺陷型。如增加核苷酸与维生素缺陷型的筛选，将这些物质组合扩大到表3-4中即可。
另一种鉴定方法是在配制基本培养基时，将20种氨基酸分别依次缺少一种而使其中含其他19种氨基酸，而后接上待测菌株， 经培养在哪种培养基上不长即需要末加的该种氨基酸。这种方法的好处是可以一次同时将需要两种以上氨基酸的菌株鉴定出来。

表3-1 氨基酸组合及用量
组 合 第一组 第二组 第三组 第四组 第五组
第六组(mg/L) 丙氨酸 40 精氨酸 20 天冬酰胺 70 天冬氨酸 70 半胱氨酸 120
第七组(mg/L) 谷氨酸 90 谷酰胺 90 甘氨酸 40 组氨酸 80 异亮氨酸 70
第八组(mg/L) 亮氨酸 70 赖氨酸 70 蛋氨酸 70 苯丙氨酸 80 脯氨酸 60
第九组(mg/L) 丝氨酸 50 苏氨酸 60 色氨酸 100 酪氨酸 90 缬氨酸 60

三、食药用菌的交配育种
物种发生遗传性变异的原因，除基因突变外就是基因重组。重组主要通过有性生殖过程而实现，生物交配是为了获得物种遗传上的基因重组，食药用菌也不例外。来自不同亲本的两个单倍体核融合后发生遗传物质的减数分裂，在此过程中基因发生分离、自由组合或交换，重组或杂交可以产生杂种优势，使食药用菌的新个体产生不同于其亲本的性状。
(一) 交配育种目标
1.提高生物转化率 目的是使食药用菌增强菌丝利用基质的能力，营养性生长旺盛，生殖性生长具有较高效率，如出菇早、菇潮齐、产量高等。
2.改善菇体品质 使菇体表现为柄短、菇形好、色泽与口感受消费者欢迎等。例如，不释放担孢子的平菇，解决了菇农呼吸道过敏问题，有十分重要的商品生产价值。
3.增强环境适应性 增强食药用菌的生活力或抗逆性，使之更能适应不良环境。实践证明，在一定范围内杂交重组的双亲间亲缘关系、生态类型差异越大的，杂交后代所形成的杂种优势越强。例如，日本的育种家从尼泊尔、不丹等国家去采集野生香菇，带回日本与当地的香菇进行杂交，改良品种，这是日本香菇产率高、品质好、商品竞争力强的原因之一。
4.固定杂种优势 食药用菌生活史的显著特点是其无性世代的质配阶段较长，而其有性世代的核配及减数分裂仅在子实体形成过程中短暂的发生于菌褶组织中。因此，有价值的食药用菌杂种一旦育成，即可通过菌丝体的无性繁殖来固定杂种优势，例如，无孢平菇的无孢性状就是依赖其菌丝的无性繁殖而保持的。食药用菌不像高等动植物那样必须进行有性生殖，导致杂交子代的性状分离，使杂种优势很快衰退。
综上所述，杂交育种是选用己知性状的亲本进行优化组合，从预见性和方向性上都比诱变育种前进了一步，是目前食药用菌育种实践中最主要、最有用的方法。张树庭等(1985年)育成了不释放孢子的佛州侧耳，笔者所在的研究组（1987）育成了无孢子的美味侧耳，这些品种在生产实践中发挥了重要作用。平菇这种无孢性状是怎么控制的? 其遗传规律又如何? 之后尤美莲等(1989)进行了研究，证明无孢突变基因是隐性的，其分离比率符合一对非连锁隐性基因的控制模式。此研究成功地运用了交配型育种以及原生质体单核化等技术，下面予以详细介绍。
(二) 交配育种技术
1.单核菌株 进行无孢平菇的有性交配育种研究，首要条
件是获得交配型清楚的单核体，详见表3-2。
表3-2 单核体的遗传背景
株 号 交配型 产孢基因 获 得 方 法
Pf1 A2B2 隐性 无孢双核菌丝经胆酸盐诱发单核化
Pf4Pf5 A1B2 A2B1 显性隐性 有孢双核菌丝经原生质体单核化同上
Pf8Pf9Pf11 A2B1 A1B1 A1B2 隐性隐性隐性 从产孢子实体上分离的单孢菌株同上同上
Pf272 A2B1 显性 从Pf4×Pf8子实体上分离的单孢菌株

2. 交配出菇 将不同交配型的单核体菌丝进行组合培养，若交配成功，镜检菌丝有锁状联合特征，将这样的双核菌丝接种到废棉培养料上，25℃发菌后，降温到20℃，并间歇给予光照刺激出菇。
3. 无孢鉴定 对大量菇体样品的初筛采用检查孢子印的方法；复筛采用光学和电子显微镜检查，无孢菇体的标准是菌褶的担子上无孢子或仅有少数败育的孢子。检查担子中细胞核的数目，用核酸的专一性荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚浸染菌褶组织。
4. 结果与分析
基因组合与产孢表型 在单核体之间进行交配获得双核体，其子实体产孢表型如表3-3。
表3-3 单核体间的交配与产孢表型
组合 亲 本 基 因 型 产孢表型
1 Pf5(A2B1)＋Pf11(A1B2) 不产孢
2 Pf5(A2B1)＋Pf4(A1B2) 产孢
3 Pf8(A2B1)＋Pf11(A1B2) 不产孢
4 Pf8(A2B1)＋Pf4(A1B2) 产孢

表3-3结果显示，组合l与组合3均形成无孢子实体;而组合2与组合4均生成有孢子实体。比较组合l与组合2，两种组合中都有亲本Pf5，但Pf5＋Pf11与Pf5＋Pf4所产生的子实体表型不同，前者产生无孢子实体，后者产生有孢子实体。由此得出结论，Pf5载有隐性无孢突变基因，当它与可亲合的另一个无孢基因载体Pf11交配时，即隐性基因纯合时无孢性状才得以表达;当Pf5与载有显性有孢基因的Pf4交配时，因显性基因的表达而产生有孢子实体。比较组合3与组合4，规律类似。
Pf8＋Pf4组合所生成的子实体大量产孢，从中分离出单孢菌株Pf272与Pf11测交，获得的子实体仍弹射孢子。收集这些孢子，萌发出单核菌株，进行如下两个检测分析:
(2)交配型分离率 随机选用单核菌株与4种交配型的测试菌株交配，目的是检测亲代交配型基因经过减数分裂后在子代中发生分离的频率，进而确定佛州侧耳的交配控制类型。在交配实验中共选用了94个被测株，其中有86个被测株与4个测试株亲和，生成具有锁状联合的双核体，其余8株不与测试株发生交配反应(原因不明)，因此，统计的分离率有些误差，四种交配型出现的理论频率应为1:1:1:1，实际频率如表3-4。
表3-4 交配类型在子代中的分离频率
菌株号交配型 Pf9A1B1 Pf1A2B2 Pf11A1B2 Pf5A2B1 χ2* P**
频 率 20 10 29 27 10.15 0.02-0.01
*χ2＝[(a-t)2/t]，a＝交配类型的实际频率，t＝交配类型的理论频率
**P为概率，P值越高，可能性越大。

由于在子代中出现了四种交配类型，其中A1B2和A2B1是亲代的两种交配型，另外的A1B1和A2B2是经减数分裂后在子代中新产生的两种交配型，这是非连锁基因自由分离的结果。由此表明佛州侧耳是A、B双因子非连锁的异宗结合控制系统。
(3)测交试验分析 从Pf272＋Pf11双核体产生的子实体上分离出230个单孢菌株，与Pf11(A1B2)回交，其中有63株(理论上A2B1亲合株占 1/4)发生亲和反应并结实，结果如表3-5。
表3-5 测交试验分析结果
测试株 被测试株 子 实 体 产 孢 结 果 χ2 P
Pf11(A1B2) 63株 (A2B1) 无孢(16) 有孢(47) 或无孢(16) 中等(29) 有孢(17) 0.0050.30 0.95-0.900.90-0.80

杂合体的两种孢子与隐性亲本回交，理论上应出现产孢、无孢1:1的比率;回交结果是产孢双核体与无孢双核体出现3:1(47:16)的分离比率。回交出现产孢和无孢两种双核体子代，表明单核体亲本Pf11携带的无孢基因为隐性，只有纯合时才得以表达;此外，结实的子代又可细分为三个等级，且无孢、中等产孢与大量产孢的比率约为l:2:1(16:29:17)，似乎表明佛州侧耳的野生型产孢基因是不完全显性，其与隐性基因杂合时表现为中等产孢，两个显性基因纯合时大量产孢。
对无孢子实体的细胞学检测表明，大多数担子上无孢子甚至无小梗，偶而发现十几个丛生的担子上各具有一个发育不成熟的孢子。用核酸染料DAPI染色后在显微镜下检测，发现担子中有2或4个核。担子中有四个核以及测交时双核子实体(Pf272＋Pf11)产生四种交配型孢子的现象表明，无孢突变并不影响担子中的减数分裂过程，电镜照片（图3-6）显示，无孢子实体的担子上无小梗和孢子，很可能是由于小梗缺如而影响了担孢子的形成。
生产实践表明，无孢菌株和有孢菌株在菌丝生长速率以及子实体产量上并没有什么差异，所不同的是无孢菌株低温实性好、菌柄偏于中生，菌褶较窄而少，菌盖较薄而易开裂，口感脆嫩柔软。由此认为，与产孢有关的一对等位基因纯合时，除不产孢外，还对平菇的其它生物性状有些影响。
四、原生质体单核化技术
原生质体作为真菌学研究的一个内容己有30年之久。细胞壁是阻碍某些遗传及生理生化研究的屏障，因此，脱壁的原生质体可以成为一种用途很广的实验系统。利用原生质体单核化技术，可以从异宗结合的某一双核体中重新分离出组成该双核体的两个单核体亲本。过去曾采用过机械、化学、饥饿三种单核化方法，各有不尽人意之处。例如，机械方法处理仅有少数细胞存活，很难同时获得两种核型的细胞(Fries & Aschan， 1952)。化学方法处理所用的药物不但均有某种程度的毒性，而且没有一种化学药物具有普遍有效的单核化效果(Miles & Raper， l956; Takemaru,1964a,1964b)。Leal-Lara & Hummel(1982)采用含少量磷酸盐和镁离子的甘氨酸培养基分离单核菌株，虽对5种14个菌株均有效，但这种方法也存在着培养条件过于严格，操作步骤太繁的缺点。
尤美莲、张树庭(1991)应用原生质体技术，对3个属的异核菌株进行了单核化研究，均成功地分离出组成每个异核体的两种单核体。鉴于原生质体单核化技术在食用菌遗传育种及生理生化研究中有多方面的潜在用途，本节对此研究作详细介绍。
(一)材料与方法
1.菌株 列干表3-6。

表3-6 单核化研究所用的菌株
种 类 菌 株 组 合 核 相 与 标 记
香 菇 3421＋1351 双核体
凤尾菇 21＋3621 双核体单核体，ade-
佛州侧耳 67＋1167 双核体单核体，ade-
灰盖鬼伞 5104＋50265104 双核体单核体，ade-
2.培养基
MYG培养基: 麦芽浸汁10.0g，葡萄糖4.0g，酵母浸汁4.0g，琼脂14g，蒸馏水1L。
PDY液体培养基: 马铃薯粉24.0g，酵母浸汁2.0g，蒸馏水1L。
基本培养基: 天冬酚胺2.0g，葡萄糖20.0g，盐酸硫胺0.12g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾0.46g，硫酸镁0.5g，琼脂14.0g，蒸馏水1L。
3.原生质体的释放和再生 所有菌株均在MYG固体培养基平皿上培养，根据各种菌的生长需要在不同温度条件下培养7-l4天 ，菌丝长满后连同培养基搅碎成菌丝片段转接种于PDY培养液保温2-6天 ，原生质体的释放量取决于最佳菌龄的掌握，收获时间的长短因菌种不同而异。用一镍网过滤收取培养物并用灭菌的甘露醇洗涤两次。将收获的菌丝体用棉绒吸干水分并称重，1g菌丝体加入3-5ml用 0.6mol/L甘露醇配制的浓度为2Omg/ml的溶壁酶液(广东省微生物所产)。在30℃条件下缓慢振动(100转/分)保温2-4小时，裂解液经注射针管中的棉柱过滤除去菌丝残片，滤出液经离心(1400×g，10分)收集原生质体。将离心管中的上清液轻轻吸出，加入0.6mol/L的甘露醇重悬浮并洗涤原生质体。
通过血球计数器计数并调整原生质体浓度约为l×l04个/ml，涂布于含有0.6mol甘露醇的高渗透压MYG平皿上使原生质体再生。
一般而言，原生质体的释放取决于三个主要因素:即菌丝细胞的生理状态、溶壁酶和渗透稳定剂(Peberdy,1989)。对原生质体有研究经验的学者大都体会到，幼龄或生长迅速的菌丝体易于释放原生质体且产率高。溶壁酶由长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)产生，用于担子菌的原生质体制备很有效。甘露糖作为渗透压稳定剂对原生质体的制备及再生均较适用。用上述体系制备原生质体效果颇佳，灰盖鬼伞原生质体的密度高达4.4×107个/ml。在难于溶壁的菌种如香菇和金针菇中，原生质体的收率也较高。
原生质体的再生率较高，最高的如佛州侧耳达9.6%，最低的是香菇异核体(34421+1315)原生质体，其再生率仅为0.96%。
双核体与单核体的再生时间显著不同。再生平皿上先出现的大型菌落基本为双核体，出现较迟的小型菌落一般为单核体(图3-7)。这表明，菌落再生时间的先后是鉴别双核体与单核体的关键因子。有些研究者未能从再生的原生质体中分离出单核原生质体的原因，恐怕是没有掌握双核体与单核体的再生时间不同这一重要规律。为了避免双核体与单核体混合生长，应将早期再生的较大菌落移走，为后来再生的单核体菌落生长留出空间。
4.再生单核体的交配型鉴定 单核体的确定是根据其没有锁状联合，而其交配型的鉴定则需通过交配试验。在交配试验中，随机选用由原生质体再生的一株单核体与其任何一个亲本单核体进行交配。虎皮香菇和金针菇没有亲本单核体，所以随机选用一个原生质体单核体作为交配对象。交配时两个不同的接种块相距约5mm，培养6-12天后，挑取交合区的菌丝镜检，根据有没有锁状联合来确定交配亲合与否。
交配型是食用菌最重要的遗传特性之一。来源于同一种菌丝体的再生原生质体姐妹株不是减数分裂的产物，因此，不会发生交配型基因的重组。根据配对试验，证明所有的原生质体单核菌株均同亲本的两种交配型相同，没有新的交配型出现。此外，还对佛州侧耳原生质体单核体的营养缺陷型标记、菌丝生长速度和菌丝形态与其亲本单核体进行了比较，结果表明，原生质体单核体与其亲本单核体没有任何差异。
电镜检查及生化研究发现，真菌菌丝的细胞壁中有一种有限的从尖端至较末端的结构(Burnett,1979)，可能影响原生质体的释放量及原生质体中所含的核数目。经相差显微镜观察原生质体中核的分布情况为: 单核、双核及无核的原生质体分别为29.6%、10.4%和60%。由此看来，一个原生质体中核的数目与两个可亲和核的核距及释放原生质体的菌丝位置有相关性。
来自3个属的不同双核菌株，单核体检出率均超过总再生菌落数的45%。在这些菌株中，从虎皮香菇l号野生菌株中分离出单核体的比例最高，占再生菌落总数的70.1%;而从佛州侧耳(67+11)异核体中分离出的单核体比例最低，占再生菌落总数的46.0%。在所有供试菌种的双核体菌株中都分离出了两种交配型的单核体。从理论上讲，从一个双核体中分离出的两种交配型数量应相等，但两种交配型在大多数情况下并不呈1:1的比例。这种不平衡反映出单核体的再生率有差异。
(二)再生单核体的应用 原生质体单核化技术提供了一种从异核体中分离两个不同单核株的途径。这种技术与常规的单孢分离法相比有两个优点: 一是不需要子实体而缩短了分离单核体的周期; 二是单核体未经减数分裂，其基因型不发生分离，有利于保存亲本的遗传特性。例如，某亲本双核体的交配型组合为AxBx+AyBy，经过结实过程中的减数分裂，则可产生四种交配型的单核体，即AxBx、AyBy、AyBx、AxBy，结果是稀释了亲本基因型。而采用原生质体单核化技术，可以重新获得两种亲本基因型AxBx、AyBy。
无孢平菇对于免除孢子过敏问题是很有价值的。但是由于不产孢子，难于得到与其他优良品种进行杂交的单核体。还有一些目前不能栽培的名贵野生食用菌如松口蘑等，得到单核体也不方便。原生质体单核化技术的应用，这些困难均迎刃而解。
原生质体融合是获得食药用菌种间或属间杂种的可行途径。但是，融合子的鉴定一直没有简便可靠的办法。目前已采用的鉴定融合子的方法包括:①锁状联合的检测; ②同工酶生化分析; ③DNA探针及聚合酶链式反应(PCR)鉴定; ④子实体性状比较; ⑤子代担孢子的遗传分析。这些方法各有局限性。在所有关于融合产物的分析报告中，仅在某些属间融合产物中以极低的比例发现了锁状联合(Toyomasu,1989)。同工酶分析的可靠性取决于生化位点的建立(Stasz等，1988)，但从事食药用菌育种的研究者往往不注重生化位点的建立，因为这类工作较为繁杂且技术上也有问题。子实体的形成被认为是最有说服力的证据，但是又不可能排除单核结实的可能性。因此，原生质体单核化技术更为有意义的应用是鉴定原生质体融合子，其原理及试验程序如图3-6。

图3-6 原生质体单核化技术鉴定融合子的原理
由亲本甲(单核体，交配型A1B1，遗传标记l)和亲本乙(单核体，交配型A2B2，遗传标记2)组成融合子异核体，经原生质体化并再生后，对出现的菌落进行交配型试验和遗传标记分析，即可区分出亲本甲、亲本乙和融合子异核体。Kirimura等(1989)用这样的分析方法，从黑曲霉(Aspergillus niger)和绿色木霉(Trichoderma viride)的融合子中分离出两个亲本单核体。此例表明，对于鉴定食药用菌异核融合子而言，原生质体单核化技术是一种直观有效很有说服力的新方法。

作者：贾乾义